酶联免疫吸附测定试验(ELISA)的操作要点.pdf

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1、2008年3月《中外健康文摘》临床医药版第5卷第3期文章编号：1672-5085（2008）03-0008-03中图分类号:R446.6文献标识码：B【论著】酶联免疫吸附测定试验（ELISA）的操作要点吴娟（北京大学人民医院北京肝炎试剂研制中心100044）【摘要】目的探讨酶联免疫吸附测定试验的操作要点。临床ELISA测定现通常为采用手工操作的以微孔板条为固相的测定模式，测定操作非常简单，一般涉及到标本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断和结果报告及解释等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚，现将操作中的体

2、会分述如下。【关键词】ELISA;测定试验;操作要点1标本的收集和保存法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆），有一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定中试时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便剂的准备最为关键的是：等标本。目前临床上使用血清标本测定的标志物一般有传染（1）在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中取出，在室温性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与胞因子和治疗药物等。室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面

3、的温育反应步用于传染性病原体的抗原和抗体的血清标本的收集则没骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，有时间和体位方面的影响，只是在处理和保存方面要考虑以以满足测定要求。下几个方面：（2）目前的ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用（1）要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶去离子水应保证质量。的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就（3）当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入

4、的HRP底色前临时配制。物反应显色，从而产生非特异性发应。3加血清样本及反应试剂（2）样本的采集及血清分离中要注意尽是避免细菌污在ELISA中一般有3次加样步骤，即加标本、加酶结合染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体物、加底物。等蛋白产生分解作用；二则对用相应酶作标记的测定方法产在现在的ELISA商品试剂盒中，血清样本的加入几乎是生非特异性干扰。唯一的要使用微量加样器加入样本的步骤。使用微量加样器（3）血清标本宜在新鲜时检测，放置时间过长均可产生加样必须注意的关键点是：假阳性反应，如在冰箱中保存过久，可发生聚合，在间接法（1）加样不可太快，要避免加在孔

5、壁上部，不可溅出和中可使本底加深。血清标本如是以无菌操作分离，则可以在产生气泡；2-8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的（2）每次加标本应更换吸头，以免发生交叉污染，有些长时间保存，应在-70℃以下。测定需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再（4）冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反加样,也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的后在微型振荡器上振荡1分钟以保证混合。蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻加酶结合物、加底物，可以使用多道微量加样器，使加结血清溶解后

6、，蛋白质局部浓缩、分布不均，应充分混匀、轻液量准确均一、加液过程迅速完成。也可使用试剂盒提供的缓、避免气泡，可上下颠倒混合，不要在混匀器上强烈振荡。滴瓶直接滴加。滴加时，除了要注意滴加的角度外，滴加的（5）标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物速度也很重要。滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔时，应离心沉淀后取上清检测。反复冻融会使抗体效价跌落，之间的现象。所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰4温育存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可以加入适当温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。防腐剂。ELISA属于固相免疫测定，抗原、

7、抗体的结合反应在固相上2试剂的准备进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异性抗体或抗在临床实验室，对试剂准备一般不太注意，通常的做法原完全结合，必须在一定温度条件下反应一定的时间。温育是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做所需时间与温度成反比，即温度越高，由所需时间相对较短。8中外健康文摘2008年3月第5卷第3期2008年3月《中外健康文摘》临床医药版第5卷第3期最为常用的温度有37℃和室温，其次是43℃和2－8℃，通常加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。目前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37℃30分钟至在目前的以