抗氧化活性乳酸菌的筛选及其遗传稳定性研究【开题报告】

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1、毕业论文开题报告食品科学与工程抗氧化活性乳酸菌的筛选及其遗传稳定性研究一、选题的背景与意义氧化反应是许多生物产生能量的必要反应。然而，过多的氧化反应也会破坏生物大分子。尽管人类和其它生物具有的抗氧化防御系统能保护他们免于氧化损伤,但这些系统对于防止氧化损伤并不能完全有效地发挥其作用。近年来证实，抗氧化剂可以被用来帮助人体减少氧化损伤，但是,合成抗氧化剂对健康和长期效应等存在安全的问题。寻找天然的安全的抗氧化剂将成为研究热点。乳酸菌广泛应用于食品工业，不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，增加

2、食品贮藏期，而且具有特殊的营养价值和生理活性。大量研究表明，乳酸菌可以调节机体肠胃道正常菌群，抑制肠道内腐败菌生长繁殖产物的产生，保持微生态平衡，促进免疫能力，还具有降低血脂胆固醇，抗肿瘤、防癌等功能，从而对机体的生理功能、免疫反应、肿瘤发生和衰老过程等产生全面的营养保健作用。因此，筛选具有抗氧化活性的乳酸菌具有很大的研究和应用价值。我国的发酵乳制品行业发展的十分迅速，但是由于在这方面的研究较少，还是出现了许多问题，例如我国保藏的发酵剂菌种大部分从国外的发酵剂中分离，对其在遗传中的稳定性并不了解

3、，这方面的研究也甚少。要想真正发展我国的发酵乳制品行业，这个问题是需要被重视的。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：以20种实验室保藏菌种为来源，从中筛选出具有抗氧化活性的乳酸菌，通过电泳的方法，分析抗氧化活性乳酸菌全菌体蛋白在传代遗传过程中的表达差异，来判断其在遗传过程中的稳定性。1．利用乳酸菌清除DPPH自由基和超氧自由基的试验，从中筛选出具有较好抗氧化活性的乳酸菌。2．通过传代培养，提取全菌体蛋白，利用SDS-PAGE电泳的方法，找出全菌体蛋白在遗传过程中的表达差异，进一步研究乳酸菌的遗

4、传稳定性。三、研究的方法与技术路线：技术路线：抗氧化活性乳酸菌的筛选乳酸菌清除自由基DPPH能力的测定乳酸菌清除超氧自由基的能力测定抗氧化活性乳酸菌的遗传稳定性传代培养菌体蛋白的制备SDS-PAGE电泳研究方法：抗氧化活性乳酸菌的筛选乳酸菌无细胞提取物的制备乳酸菌培养采用液体MARS培养基，37℃摇床培养箱中培养24h。取培养液300ml，在5000r/min下离心20分钟，去上清液去菌体，加入30mlPBS磷酸缓冲液，在5000r/min下离心20分钟，去上清液去沉淀，再加入30ml的PBS磷

5、酸缓冲液，在5000r/min下离心20分钟，去上清液，取沉淀，加去离子水30ml，经冰浴超声破碎细胞后，在4℃，12000r/min离心20min，收集上清液，即为无细胞提取物。乳酸菌清除自由基DPPH的能力测定取不同样品2.0ml，加入4.0ml（浓度为0.1mmol/L）的DPPH-乙醇溶液和1.0ml（浓度为50%）的乙醇溶液，混合均匀后，在暗处反应40分钟，并在10000r/min下离心20min，弃沉淀取上清液，在517nm下测定吸光度Ai。空白组以等体积蒸馏水代替样品溶液，并且空白

6、组空白调零。清除率=（Ai-Aj）/Ai乳酸菌清除超氧自由基的能力测定取不同样品1.0ml，分别加入4.5ml（浓度为0.1mol/L，pH为8.2）的Tris-HCl溶液，1.0ml（浓度为1mmol/L）的EDTA溶液，2.4ml的纯水和2.0ml（浓度为9mmol/L）的邻苯三酚溶液，混合均匀，反应40min后，分别加入100μL的HCl溶液（浓度为12mol/L），并在10000r/min下离心20min，弃沉淀取上清液，在325nm下测定吸光度Ai空白组以等体积蒸馏水代替样品溶液，并且

7、空白组空白调零。清除率=（Ai-Aj）/Ai抗氧化活性乳酸菌的遗传稳定性传代培养在200ml灭菌过的三角瓶中加入150mlMRS培养基，接种筛选出的具有抗氧化活性的乳酸菌1.5ml，即接种量为1%，置于37℃的恒温培养箱中培养。培养24h后，取该发酵液1.5ml，接种到装有150mlMRS培养基的200ml灭菌过的三角瓶中（接种量为1%），此为第1代，如此连续接种20天。菌体蛋白的制备分别取第1代、第5代、第10代、第15代和第20代的乳酸菌菌液适量，在4000r/min下离心20min，弃上清

8、液，加PBS磷酸缓冲液清洗，在4000r/min下离心20min，弃上清液，反复清洗2次，在菌体沉淀中加入无菌水，制成悬菌液，用超声波破碎乳酸菌（用作时间10s，间隔时间10s，破碎20分钟，破碎功率为400w），取破碎后的菌体，在4000r/min下离心20min，取上清液，即为菌体蛋白。SDS-PAGE电泳（不连续电泳）将分离胶（由pH8.8的分离胶缓冲液配制）灌入两块玻璃板之间,放置约30min，待凝聚后将上层水去尽吸干，然后在分离胶上倒入浓缩胶（由pH6.8的分离胶缓冲液配制），灌满，稍