氨基酸的测定方法比较分析

氨基酸的测定方法比较分析

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1、食物中氨基酸的测定方法 一、氨基酸自动分析仪法1.原理食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸,经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后,与茚三酮溶液产生颜色反应,再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。一份水解液可同时测定天冬,苏,丝,谷,脯,甘,丙,缬,蛋,异亮,亮,酪,苯丙,组,赖和精氨酸等16种氨基酸,其最低检出限为10pmol。2.适用范围GB/T14965-1994食物中氨基酸的测定方法。本法适用于食物中的16种氨基酸的测定。其最低检出限为10pmol。本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定3.仪器和设备3.1真空泵3.2恒温干燥箱3.3水解管:耐压螺盖

2、玻璃管或硬质玻璃管,体积20~30ml。用去离子水冲洗干净并烘干。3.4真空干燥器(温度可调节)3.5氨基酸自动分析仪。4.试剂全部试剂除注明外均为分析纯,实验用水为去离子水。4.1浓盐酸:优级纯4.26mol/L盐酸:浓盐酸与水1:1混合而成。4.3苯酚:需重蒸馏。4.4混合氨基酸标准液(仪器制造公司出售):0.0025mol/L4.5缓冲液:4.5.1pH2.2的柠檬酸钠缓冲液:称取19.6g柠檬酸钠(Na3C6H5O7.2H2O)和16.5ml浓盐酸加水稀释到1000ml,用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.24.5.2pH3.3的柠檬酸钠缓冲液:称取19.

3、6g柠檬酸钠和12ml浓盐酸加水稀释到1000ml,用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节至pH至3.3。4.5.3pH4.0的柠檬酸钠缓冲液:称取19.6g柠檬酸钠和9ml浓盐酸加水稀释到1000ml,用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。4.5.4pH6.4的柠檬酸钠缓冲液:称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠(优级纯)加水稀释到1000ml,用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。4.6茚三酮溶液4.6.1pH5.2的乙酸锂溶液:称取氢氧化锂(LiOH.H2O)168g,加入冰乙酸(优级纯)279ml,加水稀释到1000ml,用浓盐酸或50%的氢氧

4、化钠调节pH至5.2。4.6.2茚三酮溶液:取150ml二甲基亚砜(C2H6OS)和乙酸锂溶液(2.6.1)50ml加入4g水合茚三酮(C9H4O3.H2O)和0.12g还原茚三酮(C18H10O6.2H2O)搅拌至完全溶解。4.7高纯氮气:纯度99.99%。4.8冷冻剂:市售食盐与冰按1:3混合5.操作步骤5.1样品处理:样品采集后用匀浆机打成匀浆(或者将样品尽量粉碎)于低温冰箱中冷冻保存,分析用时将其解冻后使用。5.2称样:准确称取一定量样品,精确到0.0001g。均匀性好的样品如奶粉等,使样品蛋白质含量在10~20mg范围内;均匀性差的样品如鲜肉等,为减少误差可适当

5、增大称样量,测定前再稀释。将称好的样品防于水解管中。5.3水解:在水解管内加6mol/L盐酸10~15ml(视样品蛋白质含量而定),含水量高的样品(如牛奶)可加入等体积的浓盐酸,加入新蒸馏的苯酚3~4滴,再将水解管放入冷冻剂中,冷冻3~5min,再接到真空泵的抽气管上,抽真空(接近0psi),然后充入高纯氮气;再抽真空充氮气,重复三次后,在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在110±1℃的恒温干燥箱内,水解22h后,取出冷却。打开水解管,将水解液过滤后,用去离子水多次冲洗水解管,将水解液全部转移到50ml容量瓶内,用去离子水定容。吸取滤液1ml于5ml容量瓶内

6、,用真空干燥器在40~50℃干燥,残留物用1~2ml水溶解,再干燥,反复进行两次,最后蒸干,用1mlpH2.2的缓冲液溶解,供仪器测定用。5.4测定:准确吸取0.200ml混合氨基酸标准,用pH2.2的缓冲液稀释到5ml,此标准稀释浓度为5.00nmol/50μL,作为上机测定用的氨基酸标准,用氨基酸自动分析仪以外标法测定样品测定液的氨基酸含量。6.计算上机样品液(50mL)中氨基酸量(nmol)=上机标准液(50mL)中氨基酸量(nmol)×样品峰面积氨基酸标准峰面积所以,100g样品中氨基酸的mg数=上机样品液中氨基酸量(nmol)×f×Mr×100m×V×106式中

7、f--样品的稀释倍数Mr--氨基酸的相对分子量m--样品质量(g)V--上机时的进样量(此处为50μL)7.其他7.1测定条件(以Beckman-6300型氨基酸自动分析仪为例)缓冲液流量:20mL/h;茚三酮流量:10mL/h;柱温:50、60和70℃;色谱柱:20cm;分析时间:42min。7.2标准出峰顺序和保留时间序号出峰顺序保留时间/min序号出峰顺序保留时间/min1天冬氨酸5.559蛋氨酸19.632苏氨酸6.6010异亮氨酸21.243丝氨酸7.0911亮氨酸22.064谷氨酸8.7212酪氨酸24.525脯氨

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