氨基酸分析方法包测定饲料中氨基酸

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1、VenusilAA氨基酸分析方法包测定饲料中氨基酸马淑伟李倩杨定忠朱旭东孙永超(天津博纳艾杰尔科技有限公司）摘要：氨基酸分析是饲料中含氮量测定和蛋白质含量测定的一种重要辅助手段，随着反相色谱技术的发展，采用反相HPLC色谱测定氨基酸越来越普遍。本文使用Venusil-AA氨基酸分析方法包建立了饲料中氨基酸分析的HPLC方法，在50-1250nmol/mL的浓度范围内，18种氨基酸具有良好的线性范围，相关系数r大于0.999，检测限约为5pmol，具有良好的重复性和稳定性，并且通过使用不同的HPLC仪器验证了该方法具有良好的耐用性。1实验部分

2、1.1仪器高效液相色谱仪（配制要求：可梯度洗脱，紫外检测，可控柱温）；Venusil-AA氨基酸分析方法包（天津博纳艾杰尔科技，包括：VenusilAA氨基酸分析专用柱1支，4.6×250mm，5μm；PITC异硫氰酸苯酯衍生剂10瓶，25μL/瓶；含17种氨基酸的标准溶液2瓶，2mL/瓶；内标物正亮氨酸1瓶，100mg/瓶；衍生溶媒三乙胺2瓶，1.4mL/瓶）；塑料离心管，1.5mL；实验室用样品粉碎机；样品筛:孔径0.25mm；离心机；真空泵；恒温干燥箱；水解管：安瓿瓶体积20～30mL（用去离子水冲洗干净并烘干）；氮吹仪，喷灯等1.2

3、.试剂盐酸（优级纯）；无水醋酸钠（分析纯）；冰醋酸（分析纯）；乙腈（色谱纯）；去离子水；苯酚（蒸馏）；高纯氮气（纯度99.99%）；冷冻剂（市售食盐与冰按1：3混合）1.3.液相色谱条件色谱柱：Venusil-AA氨基酸分析专用柱（100Å，4.6mm×250mm，5μm）检测波长：254nm；柱温：40℃流动相A：称取15.2g无水醋酸钠，加水1850mL，溶解后用冰醋酸调pH至6.5，然后加乙腈140mL，混匀，用0.45µm滤膜过滤。流动相B：80%（V/V）乙腈溶液，进样量：2µL流速：1mL/min，梯度洗脱（不同色谱仪器，梯度洗

4、脱条件略有不同，见表1）北京市海淀区上地3街9号嘉华大厦D座811A，100085，010‐62968031，service@agela.com.cn表1不同色谱仪器洗脱梯度程序（不同型号仪器梯度条件略有不同）：时间时间时间时间时间B(%)B(%)B(%)B(%)B(%)(min)(min)(min)(min)(min)00000000005120201171420124151014713.9123334152025302930141533.0210024.520334532502934411002710033.11003310029.02

5、10041.0203310038100391003710049033.1038.1039.1037.020450450450450普析通用公司Agilent1100岛津LC-20AD岛津Waters1525L6-2HPLCHPLCLC-10AD/ATHPLC高效液相色谱仪HPLC1.4溶液配制1.4.10.1mol/L盐酸溶液：量取9.0mL浓盐酸，加去离子水稀释至1000mL。1.4.2正亮氨酸内标溶液：称取正亮氨酸约10mg，加0.1mol/L盐酸溶液10mL溶解，混匀。1.4.3三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1瓶，加乙腈8.6mL，混匀。1

6、.4.4异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯1瓶，加乙腈2mL，混匀。1.4.56mol/L盐酸(含0.1%苯酚)：称取苯酚20mg，加浓盐酸10mL和水10mL溶解，混匀。1.4.6混合氨基酸标准溶液（标液氨基酸浓度见表2）：准确量取氨基酸标准溶液1.0mL，置于5mL容量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液定容至刻度。（该溶液在4°C可保存2个月，在-20°C下可保存6个月）。1.4.7异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯1瓶，加乙腈2mL，混匀。北京市海淀区上地3街9号嘉华大厦D座811A，100085，010‐62968031，serv

7、ice@agela.com.cn表2Venusil-AA氨基酸分析方法包中的氨基酸标准溶液中各氨基酸浓度浓度浓度氨基酸分子量稀释5倍的氨基酸标准溶液浓度（μg/mL））（μmol/mL）（μg/mL）Asp133.12.5332.866.55Glu147.132.5367.873.57Ser105.092.5262.752.55Gly75.072.5187.737.54His155.162.5387.977.58Arg174.22.5435.587.10Thr119.122.5297.859.56Ala89.092.5222.744.55P

8、ro115.132.5287.857.57Tyr181.192.5453.090.60NH4Cl53.492.5133.726.74Val117.152.5292.958.58M