生物化学实验讲义(最后修改版)

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1、生物化学实验讲义生物工程教研室2007.1-26-实验学时数：32课程类别：基础课应开实验项目数：8开课学期：5面向专业：生物工程专业考核办法：考查实验教材名称：生物化学实验讲义（自编）制定大纲的依据：专业方向及生物化学教学大纲实验课教学目标：验证及巩固课堂基本理论知识，培养学生动手能力和分析问题能力。实验教学基本要求：了解实验目的、原理、方法、步骤、设备结构及仪器的使用方法；要求学生具备对新实验的基本设计能力，准确测定和读取数据，整理数据，最后得出正确的结论。-26-应开实验项目情况实验项目名称计划学时数实验目

2、的、要求每组人数同开组数实验要求实验现状实验性质主要仪器设备双缩脲法测定蛋白质含量4掌握双缩脲法测定蛋白质含量原理和方法；学好使用722型分光光度计，了解仪器基本原理132必开已开验证722型分光光度计（8台）血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳4掌握醋酸纤维素薄膜电泳的实验原理及操作方法；学习电泳仪、电泳槽的使用方法132必开已开验证电泳仪、电泳槽（8套）酶的特异性2了解酶的特异性；掌握检查酶特异的方法和原理132必开已开验证恒温水浴槽（8）离心机（6）pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响2掌握测定酶性质的方法和原理132

3、必开已开验证恒温水浴槽（8）离心机（6）核酸的水解及组成成分的鉴定4掌握核酸的一种水解方法和原理；学习测定核酸的组成成分132必开已开验证恒温水浴槽（8）可调节电炉（8）包埋法固定化酵母细胞4学习和掌握包埋法固定化酵母细胞216必开待开验证电泳仪、电泳槽（8套）维生素C的定量测定（磷钼酸法）4学习掌握维生素C测定方法216必开待开验证722型分光光度计（8台）燕麦水解蛋白的制备和理化性质测定香菇多糖的提取和理化性质测定（二选一）8学习水解蛋白的制备过程及水解蛋白理化性质测定方法学习多糖的提取方发及多糖理化性质的测

4、定方法48必开待开综合GPC高效凝胶色谱分析仪（1台）水浴锅（8个）722型分光光度计（8台）恒温摇床（8台）离心机（4个）-26-目录实验一双缩脲法测蛋白质含量…………………………………………………4实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳…………………………………………6实验三酶的特异性（专一性）…………………………………………………9实验四激活剂、抑制剂、pH、温度对酶活性的影响………………………11实验五酵母核糖核酸的水解及其组成成分的鉴定…………………………15实验六包埋法固定化酵母细胞………………………………

5、…………17实验七维生素C的定量测定（磷钼酸法）…………………………………19实验八综合设计实验（二选一）……………………………………………21-26-实验一：双缩脲法测蛋白质含量一、实验目的了解并掌握双缩脲法测蛋白质浓度的原理和方法二、实验原理具有两个或两个以上肽键（-CO-NH-）的化合物皆有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与形成紫色配合物，此反应和两个尿素分子缩合后生成的双脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm处有最

6、大吸收。在一定浓度范围内，蛋白质浓度与双缩脲反应所呈的颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。双缩脲法最常用于需要快速但不要求十分精确的测定。硫酸铵不干扰此呈色反应，但离子容易被还原，有时会出现红色沉淀。三、实验器材1．试管1.5cm×15cm8支。2．试管架：1个3．吸量管：5.0ml3支、2.0ml1支、1.0ml1支。4．S22pc型分光光度计。四、实验试剂1．双缩脲试剂：溶解1.50g硫酸铜（）和6.0g酒石酸钾钠（）于500毫升水中，在搅拌下加入300毫升10％氢氧化钠溶液，用水稀释到1升，贮存在内壁涂以石

7、蜡的瓶中。此试剂可以长期保存，以备使用。2．标准牛血清蛋白溶液：牛血清蛋白溶液浓度为5mg/ml,用0.05N(2g氢氧化钠溶于1升水中)氢氧化钠溶液配置.3．未知液：可用酪蛋白配制，未知液浓度为0.5~5mg/ml。五、实验操作1．标准曲线的绘制取干净试管6支，分别加入0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0毫升的标准蛋白溶液（牛血清蛋白溶液），用水补足到2毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂，在室温下（15－25℃）放置30分钟，于540nm波长下用分光光度计比色测定。最后以吸光度为纵坐标，蛋白含量为横坐标绘制标

8、准曲线,作为定量的依据。未知样品蛋白质浓度的测定2．吸取1毫升待测液，用水补足到2毫升，操作同前，平行做两份，于标准曲线的各管同时比色，比色后以标准曲线中查出其蛋白质浓度。-26-附录：表1绘制标准曲线编号123456加入蛋白质的量，ml0.00.40.81.21.62.0加入水的量,ml2.01.61.20.80.40.0浓度,mg/ml0.01.02.03.04.05