生物化学实验讲义.pdf

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1、生物化学实验讲义内蒙古科技大学生物与化学工程学院基础生物教学部2010年1月目录实验一氨基酸的分离鉴定—纸层析法…………………………………………2实验二琼脂糖电泳法分离DNA………………………………………………...3实验三乳中酪蛋白的分离……………………………………………………….5实验四3，5—二硝基水杨酸法测定还原糖…………………………………….6实验五蛋白质等电点测定和沉淀反应………………………………………….8实验六蛋白质的定量测定……………………………………………………...11实验七多酚氧化酶的制备和化学性质………………………………………...12实验八影响多

2、酚氧化酶作用的各种因素……………………………………...14实验九醋酸纤维薄膜电泳分离核苷酸………………………………………...16实验十维生素C的定量测定…………………………………………………...18实验十一SDS凝胶电泳法测定分子量……………………………………………20附录一生物化学实验室规则…………………………………………………...23附录二实验室安全及防护知识………………………………………………...241实验一氨基酸的分离鉴定—纸层析法一、实验目的1.学习纸层析法的基本原理和操作技术2.掌握氨基酸Rf值的计算方法3.掌握通过已知氨基酸对未知氨基酸和未知混合氨基

3、酸组分进行鉴定二、实验原理层析法又称色层分析法，根据支持物的不同分为吸附层析、离子交换层析、分配层析。纸层析是常用的、经典的分配层析技术，支持物是滤纸，固定相是水，流动相为有机溶剂。将样品点在滤纸上（这点称为原点），用扩展剂进行展层时，样品中各种的溶质即在两相溶剂中不断的进行分配，由于个溶质在两相溶剂中的分配系数（aa=溶质在流动相中的溶解度/溶质在固定相中的溶解度）不同，因而不同溶质随流动相移动的速率不等，从而将其分离开来行程距离不等的层析点。溶质在滤纸上的位置可用比移值（Rf）表示：Rf=原点到层析点中心的距离/原点到扩展剂前沿的距离对同一溶质来说，层析条件不变Rf是一

4、常数，所以可以利用溶质的Rf值做出定性分析。根据Rf值可以用已知氨基酸鉴别未知氨基酸和混合氨基酸的组分。三、实验材料、试剂和仪器1.材料、试剂（1）扩展剂将20ml正丁醇和5ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15ml水混合，充分震荡，静置后分层，放出下层水层。将漏斗内的扩展液放入磨口瓶中备用。（2）氨基酸溶液：0.5%赖氨酸；0.5%脯氨酸；0.5%缬氨酸；赖氨酸、缬氨酸、脯氨酸混合溶液各组分的浓度均为0.5%。（3）显色剂：0.1%水和印三酮正丁醇溶液2.仪器：培养皿；滤纸；表面皿；毛细管；喷雾器四、操作步骤1.取直径12.5cm圆形滤纸一张，用铅笔过圆心作两条相互垂直的线，在

5、每条线上距圆心0.5cm处做标记（画一个点）并分别在其边缘上标上赖、脯、缬、混等字样。2.用毛细管分别蘸取测定液各一滴，在滤纸的样应点样。等一次点样干了之后再点一次，重复2—3次，点样直径不超过3mm。3.用小枪头或其它在滤纸圆心扎一小孔，另取滤纸将其卷成筒状，捻紧如灯芯，底部用剪刀剪成碎条状，从滤纸的点样背面插入小孔，突出滤纸面约0.5cm。4.在表面皿中加入约3ml扩展液，再将其放入培养皿正中，将滤纸平放在培养皿上，使滤纸芯浸入到扩展液中，盖上培养皿，待扩展剂距边缘1cm时，即可取出停止层析。用铅笔画出扩展液前沿后，吹干或烘干。5.将滤纸平放在表面皿上，喷雾0.1%水和

6、印三酮正丁醇溶液再吹干或烘干，观察层析出现的弧形紫色斑。用铅笔标出原点到层析点中心的距离和到扩展液前沿的距离，计算Rf值。2实验二、琼脂糖电泳法分离DNA一、实验目的1.掌握琼脂糖电泳分离DNA的基本原理2.掌握电泳的基本操作和琼脂糖电泳在分离和鉴定DNA片段上的应用二、实验原理琼脂糖电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的主要方法，该技术操作简便、快捷，且可直接用溴化已啶进行染色，确定DNA在凝胶中的位置。在紫外灯下观察DNA条带，DNA的检出范围为1—10ng。琼脂糖是从海藻中提取出来的一种现状高聚物，加热至90℃左右时，即可形成清亮透明的液体，灌在模板上冷却后固化形成凝胶，

7、使用不同浓度的琼脂糖可以制成各种不同分辨率能力的凝胶，琼脂糖凝胶电泳对DNA的分离作用主要是依据它们的分子大小和分子形状。同时与凝胶浓度也有密切关系，不同浓度的琼脂糖凝胶适宜分离的DNA片段见下表。核酸分子带负电，在电场作用下DNA分子由负极向正极移动，在一定浓度的凝胶中较小的DNA片段迁移的速度比较大片段快。DNA片段迁移距离与其分子量对数成反比。因此通过已知大小的标准物质的迁移距离与未知的片段迁移距离进行比较，便可测出未知片段的大小。不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大，其共价闭环DNA＞线状DNA