荧光PCR定量质量控制教（学）案防污染措施方案

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1、........解放军第三0二医院王海滨写在课前的话近几年在临床检测病毒核酸和细菌核酸上，荧光定量PCR技术越来越广泛。但是如何进行治疗控制以及出现污染后怎样进行清除污染？本文主要讲述怎样来防止污染的产生。一、荧光PCR定量的概述（一）荧光PCR定量的原理实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。常规的PCR也就是电泳PCR，它是合成一个正向引物和反向引物为目的模板，即DNA或RNA作为一个模板扩增，扩增后通过跑电

2、泳的方式来检测它存在与否，是相对量的变化。由于跑电泳经常导致产物外泄，因此污染的几率比较高。近几年PCR扩增时在参入一对引物的同时参入单个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记单个报告荧光基团和单个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'端～3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有单个荧光分子构成，实现了荧光信号的累积与PCR产物构成完全同步。通过荧光物质参入和TapM

3、an探针技术来做实时荧光PCR,避免了电泳检测结果的过程,使整个PCR过程从扩增到检测都在一个封闭的状态.专业学习资料.........。荧光集团目前临床常用的有两个，一个是SYBRgreen，一个是TapMan探针。SYBRgreen是一类荧光染料，能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。变性后双螺旋变成单链，然后作为扩增的模板。在扩增的过程中由变性到负性扩出了另一条链和模板DNA进行退火变成双链。这时SYBRgreen染料与DNA双链结合,发出荧光信号。用SYBRgre

4、en荧光染料来作为指示剂时，中间要加一个溶解曲线来证实它的特异性的问题。另一个是TapMan探针，在两个引物中间设置一条特异性的探针，它标记有荧光染料通过激发和检测的过程来检测特异性扩增模板的存在。（二）PCR原理图（三）定量原理定量原理：初始模板量的对数与C(T)循环数之间的线性关系。初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少。域值～Ct值，荧光曲线由潜伏期进入对数期的拐点。Log浓度与循环数呈线性关系（如图二），根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量.专业学习资料.......

5、..图一为PCR扩增曲线图二为：标准曲线（四）TaqMan探针法TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3p→5p外切核酸酶活性，切断探针产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合,所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间.探针的5p端标记有报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3p端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，如TAMRA.专业学习资料.

6、........等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3p→5p外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团,其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以,每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度代表了模板DNA的拷贝数。二、质量指标荧光PCR质量控制。一个好的结果必须有一个好的试剂，有合格的操作人员，有合格的环境等因素。（一）特异性首先一个好的试剂要有特异性。现在临床

7、检验用的试剂，都是要求国家药监局所批的试剂，因此它序列的特异性都是通过专家所认证的。但是用SYBRgreen染料进行定量时，要注意在放射学应用之前或在确定放射学是不是可用时，要通过溶解曲线来对这个方法做一个特异性的评价。另外要注意交叉性的问题，特别是做细菌16sRNA的检测，试剂制备是在国家严格要求的GMP厂房里生产。试剂出厂后运输到检测单位，他们使用的环境基本上不具备GMP厂房的条件。因此如果检测的试剂要求比较高，在GMP厂房或在一个标准的PCR实验室里面才能做的比较合格，而在一个现有的实验室，虽然通过验收但是环境

8、要比GMP厂房要求的环境差，所以两个应该有同步性。就是说在GMP厂房好的条件下生产的试剂，放到现有的实验室里面也应该得到同样一个实验结果。如果我们现在的实验条件出现了交叉性的污染问题，即我们环境里面就存在一个16sRNA这样的菌株，那我们现有的检测结果就没有可靠性。（二）敏感性.专业学习资料.........一个好的试剂要有好的敏感性。有的专家