微生物大小与数量的测定

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1、微生物大小及数量的测定一、实验目的：1、学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法2、掌握对不同形态细菌细胞大小测定的分类学基本要求，增强对微生物细胞大小的感性认识3、学习并掌握使用血细胞计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法二、实验器材1、菌种：枯草芽孢杆菌、酿酒酵母2、溶液和试剂香柏油、二甲苯、美兰染液3、仪器和其他用品目镜测微尺、镜台测微尺、普通光学显微镜、擦镜纸、软布、血细胞计数板、凹载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯、试管、吸管、移液枪三、实验原理1、测微尺：微生物大小的测定，需要借助于特殊的测量工具——显微测微尺，它包括目镜

2、测微尺和镜台测微尺两个互相配合使用的部件。镜台测微尺是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为是10个小格，共100个小格，每个小格长度为0.01mm，即10μm。刻线外有一直径为φ3，粗线为0.1mm的圆，以便调焦时寻找线条。刻线上还覆盖有厚度为0.17mm的盖玻片，可保护刻线久用而不受损伤。。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每一格的相对长度。目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50个小格和100个小格两种。测量

3、时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不一样，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。球菌用直径表示大小，杆菌用长和宽来表示大小2、显微镜计数：显微镜计数是将少量待测样品的悬浮液置于一种特定的具有确定容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接

4、观察、计数的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们可用于各种微生物单细胞（孢子）悬液的计数，基本原理相同。其中血细胞计数板较厚，不能用油镜，常用于个体相对较大的酵母细胞、霉菌孢子等的计数，而后两种计数器浇薄，可拥油镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了使用上述这些计菌器外，还有用已知颗粒浓度的样品如血液与未知浓度的微生物细胞样品混合后根据比例推算后者浓度的比例计数法。显微镜计数法的优点是直观、快速、操作简单，缺点则是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和，

5、且难以对运动性强的活菌进行计数。目前已有一些方法可以克服这些缺点，如结合活菌染色、微室培养以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的，或用染色处理等杀死细胞以计数运动性细菌等。本实验以常用的血细胞计数板为例对显微计数法的具体操作的具体操作进行介绍。血细胞计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。中央较宽的平台又被一短槽横隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分成9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分为25个中方格，而每个中方格又分为16个小方格；另一种是一个

6、大方格分为16个中方格，而每个中方格又分为25个小方格，但无论哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是400个。每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm²，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm³。计数时，通常数5个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘以25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。以25个中方格的计数板为例，设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，则：1ml菌液中的总菌数=A÷5×25×10^4×B血球计数板

7、的构造血球计数板网的分区与分隔3．菌种的选取：微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。从分类角度来说，对不同形态微生物细胞大小的测量有不同的要求。例如，球菌是用直径范围表示其大小，杆菌和螺菌则是用细胞的直径和长度的范围来表示，但杆菌测量的是细胞的直接长度，而螺菌测量的是菌体两端的距离而非细胞实际长度。一般来说，同种不同个体的细菌细胞直径的变化范围较小，分类学指标价值更大，而长度相对来说变化范围较大。显微镜直接计数法适宜对能在液体中均匀分散的微生物细胞或孢子的数量进行直接计数。通常使用的血细胞计数板不适合使用油镜

8、，因此采用个体较大的酵母细胞及霉菌孢子作为实验材料，以保证实验的观察效果。四、实验步骤：（1）菌体大小的测定：1、目镜测微尺的安装：取出目镜测微尺，把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜筒内的隔板上，然后旋上目