分子生物实习指导

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1、实习一细菌培养基的配制及高压灭菌实习二大肠杆菌的活化培养实习三大肠杆菌的扩大培养及菌液浓度的测定实习四大肠杆菌感受态的制备实习五热激法转化大肠杆菌实习六大肠杆菌质粒DNA的提取实习七质粒DNA纯度及浓度的测定实习八PCR检测转化子实习九植物总DNA提取实习一细菌培养基的配制及高压灭j一、实习目的配制大肠杆菌LB培养基并灭菌；为大肠杆菌活化培养作好准备。二、实习用具及药品电子天平、量筒(100ml)、容量瓶(1L)、pH计、玻璃棒、瓶子、封口膜、橡皮筋、高压灭菌锅。三、实习药品酵母浸膏、胰蛋白月东、氯化钠、琼脂、INNaOH.INHC1。四、实习方法1、LB液体培养基配置：

2、胰蛋白月东或蛋白豚10g/L酵母浸膏5g/L氯化钠(NaCl)10g/L溶于600-800ml去离子水屮，加去离子水至总体积1升，调pH至7.5,分装成100ml/瓶，高压下蒸气灭菌16分钟。胰蛋口月东是经过胰酶处理过的蛋白月东，处理后，人分子的蛋白分子量变小，细菌更容易利用，此外，还含有瞟吟，提供生长因子。培养大肠杆菌，普通蛋白月东代替胰蛋白豚是没有问题的。胰蛋白腺为细菌的生长提供氮源。其次培养基屮的酵母浸膏主要成分是氨基酸，小肽，核甘酸，B族维生素，主要为细菌提供维生素和微量元素，是细菌生长所必须的。氯化钠在培养基中的作用是维持渗透压,也可提供无机盐。2、LB固体培养

3、基配置：液体培养基中加15g琼脂粉(agar)/升，分装成100ml/瓶，高压灭菌。3、培养基的灭菌培养基屮含有大量的有机物，是各种微生物滋生、繁殖的极好场所。而培养材料需耍在无菌条件下培养很长时间，如呆培养基被微生物所污染，便达不到培养的预期效果。因此，培养基的灭菌，是十分重耍的环节。培养基灭菌的方法有多种，我们这里用髙压蒸汽灭菌法。把分装好的培养基及所需灭菌的各种用具，装入高压灭菌锅的消毒筐内，锅中水位加到所需水平。将灭菌锅的消毒筐放入高压锅屮，盖好锅盖。打开灭菌锅开关，调整灭菌条件为，121°C下保持16分钟。灭菌结束后取出培养基，写好培养基编号置于准备间备用。实习

4、二大肠杆菌的活化培养一、实习目的学习划平板的技术，掌握大肠杆菌活化方法。二、实习用具超净工作台、酒精灯、酒粘棉球、无菌培养皿、接种环、移液枪及枪头。三、实习药品预先配制好的LB固体培养基。四、实习方法1、LB固体培养基的溶化将100ml的LB固体培养基置于微波炉加热，使英完全溶化。2、倒平板将完全溶化的LB固体培养基摇匀，准备好灭菌过的培养皿，将培养基倒入培养皿中，100ml培养基倒41111。3、划平板待培养基冷却凝固，表面水分挥发后，用接种环蘸上人肠杆菌划平板。然后盖上培养1111并封好。5、大肠杆菌的培养将培养皿倒置于培养箱中37°C暗培养。实习三大肠杆菌的扩大培养

5、及菌液浓度的测定一、实习目的学习液体扩大培养大肠杆菌的技术，掌握紫外分光光度计测定菌液浓度的方法。二、实习用具超净工作台、酒精灯、酒精棉球、三角瓶、牙签、摇床、紫外分光光度计、移液枪及枪头。三、实习药品预先配制好的LB液体培养基。四、实习方法1、液体扩大培养大肠杆菌从上次活化的大肠杆菌固体培养基上挑取大肠杆菌单菌落T5mlLB液体培养基屮于，37°C220rpm振荡培养至指数生长期（过夜）。菌液按1：50进行扩大培养，37°C,280rpm适应性培养2・3h。2、紫外分光光度计测定菌液浓度1）打开电源，紫外分光光度计开机自检5mino2）选择'cellculture',用

6、重蒸水洗涤比色皿,吸水纸吸干，加入附加Amp的LB液体培养基，放入样品室的S池架上，关上盖板。3）选择'setref"校零。4）把装有大肠杆菌菌液的比色1111放进样品室的S架上，关闭盖板。5）选择'enter'测定600nm波长时的0D值并记录。ODeoo值为0.55左右适于下一步制备感受态。实习四大肠杆菌感受态的制备一、实习目的掌握C&C12法制备大肠杆菌DH5a感受态的具体操作。二、实习用具超净工作台、酒和灯、酒和棉球、离心管、离心机、装有冰的冰盒、移液枪及枪头。三、实习药品氯化钙（CaCl2,无水，分析纯）。四、实习步骤1）取0%。约0.5-0.7的大肠杆菌菌液;

7、2）菌液在冰上冷却10分钟，超净工作台上转入10ml离心管中，于0-4°C,4000rpm离心1分钟;3）超净工作台上倒净上清，用5ml冰冷的0.lmol/L氯化钙溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟；4）0-4°C,4000rpm离心10分钟，超净工作台上，弃上清，加入lml冰冷的0.lmol/L氯化钙溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置片刻，即制成了感受态细胞;5）将感受态细胞分装为100ul/管，4°C放置，48小时内均可用于转化。实习五热激法法转化大肠杆I一、实习目的掌握热激法转化大肠杆菌DH5a的具体操作。二、实习用具超净工