DB37T3533-2019驴骡马皮张源性成分鉴定实时荧光定性PCR法

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1、ICS65.020.01B40DB37山东省地方标准DB37/T3533—2019驴骡马皮张源性成分鉴定实时荧光定性PCR法Identificationofdonkey,mule/hinnyandhorsederivedmaterialsinleatherReal-timefluorescentPCRmethod2019-03-21发布2019-04-21实施山东省市场监督管理局目次前言H1范围12规范性引用文件13术语和定义14原理15试剂或材料15.1试剂15.3.2材料28.3配制溶液26仪器设备37检测用引

2、物和探针38试验步骤38.1样本制备3%1DNA提収3&3实时荧光PCR反应39试验数据处理49.1PCR有效性判定49.2检测结果分析和表述410检测过程中防止交叉污染的措施4附录A（规范性附录）实时荧光定性PCR引物/探针序列、反应体系和结果判定5附录B（资料性附录）目的基因扩增靶标参考序列7本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准rti山东省畜牧专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心、山东东阿国胶堂阿胶药业有限公司、山

3、东宏济堂制药集团股份有限公司、济南张景牧业科技发展有限公司。本标准主要起草人：张全芳、胡悦、范阳阳、刘艳艳、董书光、徐慧敏、孟朝红、余彩娟、耿加亮、郝大魁、张同清、谭晴晴、步迅、陈淑娟。驴骡马皮张源性成分鉴定实时荧光定性PCR法1范围本标准规定了驴、骡和马3种动物皮张源性成分的实时荧光定性PCR检测方法。本标准适用于动物皮张及初加工品中驴、骡和马3种源性成分的定性检测。本方法检出限为0.5%。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用

4、文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光PCRreal-timefIuorescencePCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，对未知模板进行定性或定量分析。3.2Ct值cyclethreshoId每个实时荧光PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理根据核基因CKM(creatinekinaseo

5、fmuscle)为靶基因设计马属动物通用引物以及驴和马特异性探针，采用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增，根据PCR扩增反应的荧光信号及循环阈值，判定动物皮张驴、马和骡3种动物源性成分。5试剂或材料除另有规定外，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级水。1试剂5.1.1氯化钠(NaCl)o5.1.2浓盐酸(HCl)o5.1.3三轻甲基氨基甲烷(Trisbase)。5.1.4二水乙二胺四乙酸二钠(NazEDTA・2II2O)。5.1.5十二烷基硫酸钠(SDS)o5.1.6蛋白酶冻干品。5

6、.1.7异硫氟酸弧(GuSCN)o5.1.8硅珠。5.1.9无水乙醇。5.2材料5.2.1驴、骡和马3种动物皮张源性成分实时荧光PCR定性检测试剂盒。5.2.22XTaqManMasterMix：含有TaqDNA聚合酶(终浓度1U/20pL)>Mg2*(终浓度2.Ommol/pL)、dNTPs(终浓度0.2mmol/pL)。5.3配制溶液11mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液:称取12.1g三羟甲基氨基甲烷置于100n±烧杯中,加入80mL水,用浓盐酸调节pH至8.0,转移至100mL容量瓶中，加水定容至

7、刻度，103.4KPa蒸汽压(121°C)灭菌20min,室温保存待用。1mol/LTris-HCl(pH6.4)溶液：称取12.1gTris置于100mL烧杯中，加入80mL水，用浓盐酸调节pH至6.4,转移至100rnL容量瓶中，加水定容至刻度,103.4KPa蒸汽压(121°C)灭菌20min,室温保存待用。0.5mol/LEDTA(pH8.0)溶液:称収18.61g二水乙二胺四乙酸二钠置于100mL烧杯中,加入80汕水，用10%的氢氧化钠溶液调节pll至8.0,转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，10

8、3.4KPa蒸气压(121°C)灭菌20min,室温保存待用。10%SDS：称取10g十二烷基硫酸钠溶解于80mL无菌水中，转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度。储存于灭菌过的容器中待用。5mol/L氯化钠溶液：称取29.22g氯化钠溶解于80讥无菌水中，转移至100mL容量瓶屮，加水定容至刻度，103.4KPa蒸汽压(121°C)条件下灭菌20min,