gbt 25165-2010 明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光pcr法

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1、ICS65．020．30B43雪亘中华人民共和国国家标准GB／T25165—2010明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法Protocolofidentificationofbovine，caprine，ovineandporcinederivedmaterialsingelatin--RealtimePCRmethod2010-09-26发布2011-05-01实施宰瞀鹊鬻瓣訾矬瞥霎发布中国国家标准化管理委员会仪19前言GB／T25165—2010本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标

2、准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：陈颖、吴亚君、袁飞、王晶、徐宝梁、张舒亚、杨海荣、王斌、赵勇胜。明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法GB／T25165—20101范围本标准规定了明胶中牛、羊、猪源性成分的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测。该方法的检出限为0．1％。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些

3、文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法GB6783食品添加剂明胶GB／T14699．1饲料采样GB／T27403--2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3．1实时荧光PeRrealtimePCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。3．2Ct值cyclethreshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理利用实时荧光PCR技术，根据不同物种的特异性基因序列对牛、

4、羊、猪源性成分进行鉴定。利用裂解液破碎细胞，酚、三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行内参照基因的实时荧光PCR检测，以确定样品DNA的提取效率；通过特异性引物和标记荧光物质探针进行牛、羊、猪源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定，实现对明胶中牛、羊、猪源性成分的定性分析。5检测用引物和探针内参照引物探针序列及牛、羊、猪特异性引物探针序列见表1。GB／T25165—2010表1检测用引物和探针名称序列目的基因内参照5’端引物5r_CCTGAGAAACGGCTACCAT一3

5、’内参照3’端引物5t_CGTGTCAGGATTGGGTAA●37真核生物18SrRNA基因内参照探针5'-(FAM)一TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-(TAMRA)37牛5’端引物51_CCGATGGATGTGTTCAGAGCT_3’牛3’端引物5j_GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC-3’生长激素基因牛探针5’一(FAM)一TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA-(TAMRA)一3’羊57端引物51ACACAACTTCTACCACAACCC一3’羊3’端引物51_AAACAATGAGGGTAACGAG

6、GG-3’线粒体细胞色素b基因羊探针51_(FAM)一ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA(TAMRA)一3’猪5’端引物5'-TTTGTGCATGACTGCGTCAAC-3’猪3’端引物5’C'I叮GGTGGTCGTGGTCACTGT-3’朊蛋白基因猪探针5’一(FAM)一CACCGTCAAGCAGc_(NFQ)(MGB)一3’6试剂苯酚(Tris饱和酚，pH8．0)、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、异丙醇、70％乙醇。除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB／T6682中二级水的要求。7配制溶液7．1裂解液成

7、分包括：2％(质量浓度)CTAB(cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)，i00mmol／I。Tris(trishydroxymethylaminomethane，三羟甲基氨基甲烷)，1．4mol／LNaCl，20mmol／LEDTA(ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸)，用HCI调至pH8．0。7．2实时荧光PCR反应混合液12．5“L反应体系包括：1u～2U(Unit，酶学单位)的Taq酶、1×PCRbuffer、2．5mmol／L～4．0mmol／L的Mg”

8、、0．2u～1U的UNG酶、0．2mmol／L的d(A，C，G)TPs、0．2mmol／I，～0．4mmol／LdUTP、400nmol／LROX染料(某些荧光PC