动物产品中马、驴、骡源性成分的定性检测方法　实时荧光PCR法（定稿）

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1、ICS65.020.01B40DB37山东省地方标准DB37/T××××—××××动物产品中马、驴、骡源性成分的定性检测方法　实时荧光PCR法Qualitativedetectionofhorse,donkeyandmulederivedmaterialsinfeedandrelativeproducts—Real-timePCRmethod-××-××发布××××-××-××实施山东省市场监督管理局发布DB37/T××××—××××前  言本标准按照GB/T1.1—2009的规则起草。本标准由山东省市场监督管理局提出、归口并组织实施。本标准起草单位：山东省产品质量检验研

2、究院、青岛朗天科技服务有限公司。本标准主要起草人：王一村、郗丹、李娜、高静静、侯广月、周莉莉、许士明、徐正、才美佳、王诚、康兆广、苏本玉、邹惠玲、张鹏。本标准为首次发布。6DB37/T××××—××××引  言动物相关产品中骡源性成分的检测目前没有国家标准和相关行业标准，且现有的基于实时定量PCR技术的驴、马源性成分鉴定无法排除骡源性成分的干扰。本标准主要适用于动物原材料及动物相关产品的检测，不适用于动物深加工产品（如阿胶及其附属产品）的检测。6DB37/T××××—××××动物产品中马、驴、骡源性成分的定性检测方法　实时荧光PCR法1　范围本标准规定了动物原材料及动物相

3、关产品中马、驴、骡源性成分检测方法。本标准适用于动物原材料及动物相关产品的定性检测。本标准不适用于动物深加工产品（如阿胶及其附属产品）的检测，本方法的最低检出限（LOD）为100mg/kg。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测SN/T1193　基因检测实验室技术要求3　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1　荧光定量PCR技术在

4、PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。3.2　Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.3　已知来源于单一动物源性成分的样品从肉眼上可判断出其材料来自于同一个生物有机体的样品（如一张皮毛等固定的动物组织）或有证据表明其来源于同一种生物有机体且未经其他源性成分干扰过的样品。4　原理骡为马和驴杂交的后代，含有马和驴的核基因双重遗传背景。利用TaqMan实时荧光PCR技术，根据动物核基因组中编码肌肉肌酸激酶（creatinekinasemuscle，ckm6DB3

5、7/T××××—××××）基因上各物种间（尤其是马和驴）基因序列差异而进行动物源性成分鉴定。利用各类方法提取得到高纯度DNA，以提取的DNA为模板进行内参照基因的实时荧光PCR检测，以确定样品DNA的提取效率和PCR反应体系是否满足要求。通过特异性引物和标记荧光物质探针进行马、驴、骡源性成分的荧光PCR扩增，根据PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定实现对马、驴、骡源性成分的定性分析。其中，马源性成分应有马的荧光信号，驴源性成分应只有驴的荧光信号，骡源性成分同时含有马和驴的荧光信号。因此，被检样品如检出马源性成分，未检出驴源性成分，可断定样品含有马成分。如检出驴

6、源性成分，未检出马源性成分，可断定样品含有驴成分。如检出马和驴源性成分，且样品为已知来源于单一动物源性成分的样品，可断定样品含有骡成分。1　仪器和设备1.1　电子天平，感量0.01g。1.2　微量可调移液器（最大量程为10μL、20μL、100μL、1000μL）。1.3　恒温水浴锅。1.4　磁力搅拌器。1.5　高速冷冻离心机。1.6　二级生物安全柜。1.7　高压灭菌锅。1.8　普通冰箱：4℃，-20℃。1.9　pH计。1.10　核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。1.11　实时荧光定量PCR仪。2　试剂和材料2.1　试剂的配制及试验中的操作规范应按GB/T27403和SN/

7、T1193的规定执行。2.2　除另有规定外，试剂应为分析纯或化学纯级别，实验用水应符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。2.3　检测用引物和Taqman探针序列（详见表1）。表1　检测用引物和Taqman探针名称序列（5’—3’）目的基因内参照5’端引物内参照3’端引物内参照探针F:5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’R:5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’P:5’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-TRA