产高效细菌素乳酸菌的筛选及鉴定

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1、产高效细茵索乳酸茵的筛选及鉴左摘要：本研究旨在从口然生境中筛选产高效抑菌蛋白的乳酸菌，并进行抑菌活性分析和菌种鉴定。通过牛津杯法抑菌试验对样木屮乳酸菌进行初筛，然后对发酵液进行排除酸、过氧化氢干扰和蛋口酶处理，进一步复筛出产抑菌蛋口的乳酸菌。通过形态学、生理生化、糖发酵(API)和16SrDNA基因序列同源性分析进行菌种鉴定。结果表明:本研究成功地筛选出2株対金黄色衙萄球菌、单增李斯特菌等致病菌有高效抑制作用的乳酸菌(抑菌圈直径均＞20mm),证明其抑菌物质为蛋白类物质并推测为细菌索，菌种鉴定为植物乳杆菌和粪肠球菌。本试验对高效细菌素一乳酸菌的研究为食殆及饲料

2、行业中乳酸菌素的开发和应用提供参考。关键词：乳酸菌；细菌素；筛选鉴定；抑菌活性畜牧牛产中抗牛:素滥用、病源微牛物耐药性等问题严重威胁着食品安全及人类健康，越来越多的研究致力于寻找新型安全有•效的绿色饲料添加剂作为理想的抗牛素替代品。细菌素是细菌在牛•长过程中通过核糖体途径合成并分泌到坏境中的具有抑菌作用的蛋白或多肽物质，具有高效、无毒、耐高温、无残留、无抗商性等优点[1]。目前国内外対细菌素的研究主耍集中在芽他杆菌和乳酸菌上，乳酸菌是一类可发酵碳水化合物、产生人量乳酸050%)的革兰氏阳性球菌或杆菌的统称⑵o饲料中添加乳酸菌制剂町以促进动物胃肠道微牛态平衡，改

3、善动物健康[3]O我国《饲料添加剂品种目录(2010)》中允许添加的29种微牛:物菌种中有9种属于乳酸菌属。添加植物乳杆菌的发酵饲料中粗蛋口、粗脂肪含量明显上升，提高饲料利用率[4]oRiboulet等[5]研究表明，乳杆菌素Abpll8对小鼠和猪的肠道沙门氏菌等致病菌有显著的抑制作用并彫响动物机体免疫力。因此对乳酸菌细菌素抑菌能力的挖掘成为开发绿色饲料添加剂的重点。木试验旨在筛选出对病原菌冇高效、广谱抑菌活性的产细菌索乳酸菌菌株，并对其进行菌株鉴定，为天然女全的饲料添加剂的开发提供理论依据。1材料与方法1.1材料与试剂生境材料(酸菜、生牛奶、青贮料、土壤等)

4、；指示菌为单增李斯特菌(L.monocytogenescvccl599)；金黄色葡萄球菌(S.aureuscvcc26003)；藤黄八叠微球菌(S.luteacmcc28001)；大肠杆菌(E.coilcvcc245)；沙门氏菌(S.typhimuriumcvcc541)；培养基(MRS、BPY、LB等)，药詁采用国产分析纯；细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根主化有限公司)；AnalyticProductsINCAPI50CH试剂盒(法国梅里埃)。16SrDNA的PCR扩增引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’、1525R：5’-A

5、GAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'。1.2产抑菌物质乳酸菌的初筛乳酸菌的分离与培养：将收集的样本悬浮于无菌牛理盐水屮按梯度稀释,涂布于含漠甲酚紫指示剂(0.01%)的MRS琼脂平板上，37°C培养箱培养48h,挑选培养基变黄的菌落划线纯化，选取镜检革兰氏染色阳性、无芽孑包的菌株于MRS液体培养基中37°C培养12h作为种子液。种子液按2%接种于新的MRS液体培养基37°C静置培养36h作为发酵液。以8000r/min离心10min,取上清液备用。指示菌的制备：选取的4株指示菌中大肠杆菌用LB培养基，其余用BPY培养基，种子液按2%接种于液体培养基37

6、6C>150r/min摇床过夜(浓度约达109个/mL),稀释到107CFU/mL备用。菌株抑菌试验初筛：采用牛津杯法。取备用指示菌(107CFU/mL)150uL涂布于BPY琼脂平板上,放置3个牛津杯/板，常温干燥30mine取菌株发酵上清200uL加入牛津杯内，以空口培养基为对照，3个重复/样，置于37°C培养24h,测定抑菌圈直径d(mm)。选取抑菌效杲较好的菌株进行复筛，用甘汕-20€保种备用。1.3产抑菌蛋白乳酸菌的复筛同上制作初筛菌株的发酵液和指示菌液。检测各菌株发酵上清液的pH值，并对发酵上清进行排酸、过氧化氢酶和蛋白酶处理：①上清原液；②用Na

7、OH调节上清至pH5.5；③调节上清至pH7.2并用过氧化氢酶、蛋白酶(lmg/mL)处理，37°C温育2h后调回冈至5.5[6]:④对照：用乳酸、乙酸调节pH为4.0的培养基。牛津杯法测抑菌活性。选用单增李斯特菌、藤黄八叠微球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌作为指示菌，牛津杯法测定各菌株发酵上清抑菌活性，分析各菌株抑菌效果并筛选出含有高效抑菌蛋口的乳酸菌作为目标菌株。1.4菌株的鉴定形态学鉴定：将F1标菌株划线于MRS琼脂平板，37°C培养48h,观察菌落形态，挑収单菌落进行革兰氏染色镜检。生理生化鉴定：对菌株进行接触酶、硝酸还原、产氨、水解、H2S、

8、VP、呵喙、明胶液化等试验（参照《乳酸