产高效细菌素乳酸菌的筛选及鉴定

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产高效细茵索乳酸茵的筛选及鉴左摘要：本研究旨在从口然生境中筛选产高效抑菌蛋白的乳酸菌，并进行抑菌活性分析和菌种鉴定。通过牛津杯法抑菌试验对样木屮乳酸菌进行初筛，然后对发酵液进行排除酸、过氧化氢干扰和蛋口酶处理，进一步复筛出产抑菌蛋口的乳酸菌。通过形态学、生理生化、糖发酵(API)和16SrDNA基因序列同源性分析进行菌种鉴定。结果表明:本研究成功地筛选出2株対金黄色衙萄球菌、单增李斯特菌等致病菌有高效抑制作用的乳酸菌(抑菌圈直径均＞20mm),证明其抑菌物质为蛋白类物质并推测为细菌索，菌种鉴定为植物乳杆菌和粪肠球菌。本试验对高效细菌素一乳酸菌的研究为食殆及饲料行业中乳酸菌素的开发和应用提供参考。关键词：乳酸菌；细菌素；筛选鉴定；抑菌活性畜牧牛产中抗牛:素滥用、病源微牛物耐药性等问题严重威胁着食品安全及人类健康，越来越多的研究致力于寻找新型安全有•效的绿色饲料添加剂作为理想的抗牛素替代品。细菌素是细菌在牛•长过程中通过核糖体途径合成并分泌到坏境中的具有抑菌作用的蛋白或多肽物质，具有高效、无毒、耐高温、无残留、无抗商性等优点[1]。目前国内外対细菌素的研究主耍集中在芽他杆菌和乳酸菌上，乳酸菌是一类可发酵碳水化合物、产生人量乳酸050%)的革兰氏阳性球菌或杆菌的统称⑵o饲料中添加乳酸菌制剂町以促进动物胃肠道微牛态平衡，改善动物健康[3]O我国《饲料添加剂品种目录(2010)》中允许添加的29种微牛:物菌种中有9种属于乳酸菌属。添加植物乳杆菌的发酵饲料中粗蛋口、粗脂肪含量明显上升，提高饲料利用率[4]oRiboulet等[5]研究表明，乳杆菌素Abpll8对小鼠和猪的肠道沙门氏菌等致病菌有显著的抑制作用并彫响动物机体免疫力。因此对乳酸菌细菌素抑菌能力的挖掘成为开发绿色饲料添加剂的重点。木试验旨在筛选出对病原菌冇高效、广谱抑菌活性的产细菌索乳酸菌菌株，并对其进行菌株鉴定，为天然女全的饲料添加剂的开发提供理论依据。1材料与方法1.1材料与试剂生境材料(酸菜、生牛奶、青贮料、土壤等)；指示菌为单增李斯特菌(L.monocytogenescvccl599)；金黄色葡萄球菌(S.aureuscvcc26003)；藤黄八叠微球菌(S.luteacmcc28001)；大肠杆菌(E.coilcvcc245)；沙门氏菌(S.typhimuriumcvcc541)；培养基(MRS、BPY、LB等)，药詁采用国产分析纯；细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根主化有限公司)；AnalyticProductsINCAPI50CH试剂盒(法国梅里埃)。16SrDNA的PCR扩增引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’、1525R：5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'。1.2产抑菌物质乳酸菌的初筛乳酸菌的分离与培养：将收集的样本悬浮于无菌牛理盐水屮按梯度 稀释,涂布于含漠甲酚紫指示剂(0.01%)的MRS琼脂平板上，37°C培养箱培养48h,挑选培养基变黄的菌落划线纯化，选取镜检革兰氏染色阳性、无芽孑包的菌株于MRS液体培养基中37°C培养12h作为种子液。种子液按2%接种于新的MRS液体培养基37°C静置培养36h作为发酵液。以8000r/min离心10min,取上清液备用。指示菌的制备：选取的4株指示菌中大肠杆菌用LB培养基，其余用BPY培养基，种子液按2%接种于液体培养基376C>150r/min摇床过夜(浓度约达109个/mL),稀释到107CFU/mL备用。菌株抑菌试验初筛：采用牛津杯法。取备用指示菌(107CFU/mL)150uL涂布于BPY琼脂平板上,放置3个牛津杯/板，常温干燥30mine取菌株发酵上清200uL加入牛津杯内，以空口培养基为对照，3个重复/样，置于37°C培养24h,测定抑菌圈直径d(mm)。选取抑菌效杲较好的菌株进行复筛，用甘汕-20€保种备用。1.3产抑菌蛋白乳酸菌的复筛同上制作初筛菌株的发酵液和指示菌液。检测各菌株发酵上清液的pH值，并对发酵上清进行排酸、过氧化氢酶和蛋白酶处理：①上清原液；②用NaOH调节上清至pH5.5；③调节上清至pH7.2并用过氧化氢酶、蛋白酶(lmg/mL)处理，37°C温育2h后调回冈至5.5[6]:④对照：用乳酸、乙酸调节pH为4.0的培养基。牛津杯法测抑菌活性。选用单增李斯特菌、藤黄八叠微球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌作为指示菌，牛津杯法测定各菌株发酵上清抑菌活性，分析各菌株抑菌效果并筛选出含有高效抑菌蛋口的乳酸菌作为目标菌株。1.4菌株的鉴定形态学鉴定：将F1标菌株划线于MRS琼脂平板，37°C培养48h,观察菌落形态，挑収单菌落进行革兰氏染色镜检。生理生化鉴定：对菌株进行接触酶、硝酸还原、产氨、水解、H2S、VP、呵喙、明胶液化等试验（参照《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》）[13];对菌株进行49种糖发酵试验（APT50CH试剂盒）。将试验结果参照第八版《伯杰氏细菌鉴定手册》、《常见细菌系统鉴定手册》）并与API数据库进行比对。16SrDNA基因序列鉴定：利用细菌基因纟fl提取试剂盒提取忖标菌株的基因组DNA,利用乳酸菌通用引物进行PCR扩增并测序。通用引物序列：27F：5,-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、1525R：5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3/；反应体系50uL：DNA模板1uL,2XTaqPCRMix25uL,27F2uL,1525R2nL,双蒸水20uL；扩增条件为:94°C预变性5min,94°C变性30s,55°C退火30s,72°C延伸90s,共30个循环，最后72°C延伸10min。引物合成及PCR产物测序由上海英骏生物技术有限公司完成。运用NCBI上的BLAST在线软件将测序结果与GenBank数据库进行同源性比较；利用Clustalx2.0.11和MEGA5.10软件构建乳酸菌系统发育树。1.5统计分析采用Excel対试验数据初步整理，并用SPSSStatisticsl7.0软件中One-WayANOVA进行进行方差分析，以P<0.05为显苦水平，P<0.01为差异极显著，差异显著性分析应用Duncanz s多重比较。结果均以平均值土标准差表示。2结果2.1产抑菌物质乳酸菌的初筛从样本中分离出革兰氏染色阳性、无芽抱的乳酸菌72株；再通过牛津杯法抑菌试验，以金黄色葡萄球菌为指示菌筛选出有抑菌效果的菌株10株（见表1）,选取其中抑菌圈直径大于16mm的6株菌（N13、EN3、CN4、SN4、SN5、SC5）作为后续复筛菌株。此外，发现牛津杯屮发酵 上清的加样量大于150订时抑菌效果比较明显，后续试验选用此指标。表1菌株対SA的抑菌圈直径mm菌株pH发酵液上清/L50100150200N134.70+++++++++EN34.91—1+++++CN44.76—++++++SN44.17+++++++++++SN54.151+++-卜++++++AS15.07—+++++SC44.96—+++++SC54.761++++++W354.95++++++CW64.93—+++++注：抑菌圈直径“-”：＜8mm（无抑菌活性）；“+”:8~12“++1216mm；"卄+”:16~20mm；“+卄+”mm；0mm；牛津杯直径为8mm2.2产抑菌蛋白乳酸菌的复筛对初筛得到的6菌株，发酵上清液经过排酸、H02酶和蛋白酶处理后与上清原液相比，抑菌活性结果见表2。各菌株发酵液pH较低（3.90WpHW4.72）,其中SN4、SN5的产酸能力最强（pH达3.9）o排酸处理后N13和SC5抑菌活性消失，CN4、SN4、SN5抑菌活性与发酵上清相比有所降低（如图1）,但pH4.0的乳酸、乙酸对照无抑菌活性；H202酶处理后抑菌活性无切显差界；蛋口酶K和胰蛋白酶处理后抑菌活性均消失。此外，在对多种指示菌的抑菌试验屮（表3）,各菌株发酵上清液对G+有较好的抑菌活性而对G无抑菌活性；其中CN4、SN4、SN5对李斯特菌冇显著的抑菌活性（抑菌圈＞20mm；P＜0.01）,选为产高效抑菌蛋口的目标菌株。2.3菌株的鉴定2.3.1形态学鉴定如图2所示，筛选的目标菌株CN4、SN4、SN5平板培养48h后呈现自径约1〜2mm、圆形突起、乳白色、不透明的光滑菌落；镜检下细菌CN4为单个球状，SN4、SN5为短杆状或链状，均无芽抱、无鞭毛、无荚膜、革兰氏染色阳性。2.3.2生理生化鉴定参照第八版《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》 [7]并运用bioMerieux73动物生产・AnimalProduction2013年第49卷第19期注：A：乳酸菌SN4菌落形态，B和C为SN4、CN4革兰氏染色后细胞形态（XIOOoil）图2菌株的鉴定注：A：CN4、SN4、SN5对S.aureus的抑菌圈,B：SN4发酵液处理对L.monocytogenes的抑菌圈,C:SN4发酵液处理对S.aureus的抑菌圈图1乳酸菌发酵液对指示菌的抑菌活性表3目标菌株対不同指示菌的抑菌圈自径nun菌株S.aureusL.monocytogenesS.luteaE.coilS.typhimuriumN1315.75±1.06be17.50±0.71c18.50±0.71abEN314.25±0.35c16.25±0.35c17.50±0.35beCN417.50±0.71b20.25+1.06b15.75±1.06SN420.75±1.06a27.25±1.06a20.50±1.41 SN520.88±0.18a27.50+0.71a20.25±0.35aSC514.75±1.06c17.00±0.71c20.75±1.06P00.0010.00900注：同列数据肩标相邻小写字母表示差异显著（PV0.05）,相间字母表示差异极显著（PV0.01）apiweb数据库对菌株24、48hAPT发酵结果进行判读，结果鉴定CN4为副干酪乳杆菌（鉴定度：1D为99.9%；T值为0.88）；SN4、SN5同为植物乳杆菌（鉴定度：［D为99.9%；T值为0.64）O根据API50CHL试剂盒使用手册，木鉴定所得ID人于99%,T值人于0.5均为极好的鉴定结果（表4和表5）。表4菌株牛理生化试验结果试验CN4SN4试验CN4SN4H202酶--H2S产生--厌氧牛长++硝酸盐还原--V~P++u引喙--运动性--精氨酸双水解酶+-产气--明胶液化--产酸++50°C生长--精氨酸产氨--15°C生长+-注：“+”表示阳性反应；“-”阴性反应。下表同2.3.316SrDNA基因序列鉴定以菌株CN4、SN4、SN5的DNA为模板,16SrDNA通用引物进行PCR扩增后得到约1500bp的特异性扩增产物。PCR产物测序结果于NCBI中使用BLAST软件在GenBank屮进行同源性比対，SN4和SN5序列比对为同一菌株。与CN4、SN4(SN5)同源性最高的菌株分别为EnterococcusfaecalisstrainKLDS4.0341(No.GQ337884.1)和LactobacillusplantarumstrainG8(No.JX183220.1),同源性均为 99%。因此冃标菌株CN4鉴定为粪肠球菌、SN4利SN5为同株植物乳杆菌。乳酸菌系统发育树见图3。3讨论2.1产抑菌物质乳酸菌的初筛基于乳酸菌对营养物质的特殊要求，选择性培养基MRS⑻常'被用作乳酸菌的分离鉴定，以淚甲酚紫作为酸碱指示剂对将样木屮产酸的细菌初步分离出来。王有湘等⑼研究发现，相同条件卞，乳酸菌在MRS上的牛长情况和数量好于TJA、M17o抑菌试验中常用的方法包括牛津杯法、滤纸片法和浊度法。木研究采用牛津杯法对金黄色葡萄球菌的抑菌农明，发酵上清加样量人于150PL吋才有明显抑菌效果，应该是受到牛津杯限制或琼脂扩散等原因；各菌株的抑菌活性大小不等，抑菌圈直径小于14伽时抑菌活性较低，因此选取抑菌圈大于16mm的菌株作为复筛菌株。3.2产抑菌蛋白乳酸菌的复筛对于初筛得到的乳酸菌，为了排除抑菌效果中H202和酸性代谢产物(乳酸、乙酸)的影响，本研究对发酵上清进行了H202酶处理后抑菌活性无明显差异说明抑菌物质不是H20 :上清调节pH至弱酸性后抑菌活性有所降低，说明酸性物质対抑菌活性有影响；而pH4.0的乳酸表2菌株发酵上清不同处理对SA的抑菌圈直径mm菌株pH发酵液上清处理上清原液调酸P115.5H202酶蛋白晦K肌蛋口酶N134.6314.67±1.53-14.17±1.26--EN34.60CN44.72SN43.90SN53.9313.83±1.4416.50±1.3220.17±0.7619.33±1.7610.50土2.1815.17±1.0418.50±0.5017.83±0.7613.50土0.87-一16.83±1.26--19.83±1.04--19.67±1.26--SC54.4714.50±0.87-13.83±0.76--乳酸液4.0-NDNDNDND乙酸液4.0-NDNDNDXD注：“-”表示抑菌圈〈8伽或无抑菌活性，“DN”表示未测定742013年第49卷第19期AnimalProduction•动物生产管号代码底物成分CN4SN4管号代码底物成分CN4SN4025ESC七叶灵柠檬酸铁++1GLYU'露醇+-26SAL水杨昔++2ERY赤藻糖醇--27CELD-纤维二糖++3DARAD-阿拉伯糖--28MALD-麦芽糖++4LARAL-阿拉伯糖-+29LACD-乳糖++5LIBD_核糖++30MELD-密二糖-+6DXYLD-木糖--31SACD-蔗糖++7LXYLL-木糖--32TRED-海藻糖++8ADOD-侧金盏花醇1--33INU菊粉--9MDX甲基-D毗喃木糖昔--34MLZD-松三糖+-10GALD-半乳糖++35RAFD-棉子糖11GLUD-匍萄糖++36AMD淀粉-12FRUD-果糖++37GLYG糖原13MNED-甘露糖SBEL-山梨糖+38XLT木糖醇---39GEND-龙胆•二糖++15RHAL-鼠李糖-+40TURD-土伦糖--16DUL卫茅醇--41LYXD-来苏糖--17TNO肌醇・-42TAGD-塔格糖++18MAN甘露醇++43DFUCD-岩藻糖-- 15SOB山梨醇+-44LFUCL-岩藻糖--16MDM甲基-D-毗喃甘露糖昔-+45DARLD-阿拉伯醇--17MDG甲基-D-毗喃葡萄糖昔--46LARLL-阿拉伯醇--18NAGN-乙酰葡萄糖胺++47GNT葡萄糖酸钾++19AMY苦杏仁廿++482KG2酮基葡萄糖酸钾--20ARBARBUL1N++495KG5酮基葡萄糖酸钾--表5菌株对API49种糖发酵试验结果和乙酸培养基対照无抑菌活性，可推断抑菌活性不是由酸性物质所致，但较低的pll坏境可以增强其他抑菌物质的抑菌活性。Zacharof等[10]报道，乳酸菌素在PH<5环境下可以更好地吸附于靶细胞表面发挥抑菌活性；发酵上清经蛋口酶K和胰蛋口酶处理后，抑菌活性完全消失，说明发酵液中的抑菌物质为蛋图3菌株CN4、SN4与同源性属种16SrDNA序列构建的系统发育树75动物生产・AnimalProduction2013年第49卷第19期白类物质，可初步鉴定为细菌素[11]O木研究的多种指示菌的抑菌试验中，6株乳酸菌对G+(S.aureusxL.monocytogenes>S.lutea)均有抑菌活性而对G菌(E.co订、S.typhimurium)无抑菌活性,其中对L.monocytogenes的抑菌效果均显著高于S.aureus和S.luteao很多研究表明人部分细菌索只对近源菌株有抑菌活性，也有些细菌索抑菌谱比较广。Zacharof等[10]研究指出，大部分的乳酸菌素对G+细菌细胞壁冇特异吸附性。其原因可能与G+和G菌细胞壁的结构差异有关系，细菌素主要通过与靶细胞膜上的特界性受体相结合而发挥抑菌或杀菌作用。对同一指示菌的抑菌效果來看SN4、SN5发酵上清的抑菌活性极显著人于具他菌株(d>20mm),具次为CN4的抑菌活性显著大于其他菌株(d>17mm)；因此选取CN4、SN4、SN5为具有高效产抑菌蛋白的日标菌株。2.3菌株的鉴定传统的生理生化鉴定分析方法，往往述不能准确鉴定出细菌的种属。通过遗传特征的保守性序列(如16SrDNA)分析，能够判定细菌间亲缘关系的远近，从而得到准确的鉴定结果[12] O市于菌属的关系复杂，单一鉴定方法容易受到环境和自身变异的影响而不能准确鉴定其所属，因此木试验通过形态学、生理生化、API糖发酵鉴定和分了学鉴定最终确定菌株的种属。形态学和生理生化鉴定结果表明，CN4为肠球菌属，SN4、SN5同为乳杆菌属；而API糖发酵试验屮CN4鉴定为副干酪乳杆菌，SN4、SN5为植物乳杆菌，这与CN4在镜检下球状形态相冲突，进一步采用16SrDNA基因序列鉴定，在GenBank进行BLAST比对后鉴定结果为CN4为粪肠球菌，SN4、SN5为同株植物乳杆菌，因此将CN4推断为变杲的粪肠球菌菌种。CN4API鉴定和形态学、16SrDNA基因序列的鉴定结果差异，说明单一的鉴定方法不足以准确地鉴定菌株的种属，鉴定结果的差异可能是由丁•菌株口身的变界而使得生理生化特征发牛改变成为新的菌株，因此在细菌菌种的鉴定时要运用多种鉴定方法结合确定其种属。4结论本研究通过多种抑菌试验对样本中的乳酸菌进行初筛和复筛，得到2株产抑菌蛋白的口的菌株，其发酵液对G(S.aureus>L.monocytogenes>S.lutea)致病菌均冇较好的抑菌活性。通过排除酸、过氧化氢的干扰以及蛋白酶处理试验可以确定抑菌物质为蛋白类活性物质细菌素。対目标的菌株进行形态学、牛理牛化试验、API糖发酵试验和16SrDNA基因序列分析菌种鉴定并将其建立了系统发育树，鉴定结果为CN4为变异的粪肠球菌，SN4和SN5为同株植物乳杆菌。本试验将进一步研究1=1标菌株的生物学特性、抑菌范围、细菌素的分离和纯化和鉴定等，为-其应用于青贮饲料、微生物饲料和饲料添加剂方而提供参考和依据。参考文献：[1]郭兴华.益生乳酸细菌分子生物学及生物技术M.北京：科学出版社，200&[2]ZaunmullerT,EichertM,RichterH,etal・Variationsintheenergymetabolismofbiotechnologicallyrelevantheterofcrmenta-tivelacticacidbacteriaduringgrowthonsugarsandorganicacids[J].ApplMicrobiolBiot,2006,72(3):421-429.[3]ClevelandJ,MontvilleTJ,NesIF,etal.Bacteriocins:safe,naturalantimicrobialsforfoodpreservation[J].IntJFoodMicrobiol,2001,71(1):1-20.[4]CuiZZ.StudyonapplicationofLactobacillusplantarumusedinfeed[J].FeedandHusbandry,2009,1(1):35~37.[5]Riboulet-BissonE,SturmeMHJ,Jeffery1B,etal.EffectofLactobacillussalivariusbacteriocinAbpll8onthemouseandpigintestinalmicrobiota[J].PLoSOne,2012,7(2):e31113.[6]刘丽，郝彦玲，张红星.肉制品中产细菌素乳酸菌的分离及鉴定[J].中国农学通报，2011,27(2):424-42& 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