正文描述:《浅论血管紧张素对增生性瘢痕成纤维细胞纤维连接蛋白合成的影响》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、浅论血管紧张素对增生性瘢痕成纤维细胞纤维连接蛋白合成的影响作者:陈艳清李世荣曹川冯智夏珊李丹[论文关键词]血管紧张素II;逆转录聚合酶链反应;增生性瘢痕;成纤维细胞;纤维连接蛋白[论文摘要]口的:探讨血管紧张素II(Angll)及其I型、II型受体阻断剂和钙调神经磷酸激酶(CaN)的阻滞剂环胞素A(CsA)对增半性瘢痕来源的成纤维细胞纤维连接蛋白mRNA和蛋白表达的作用。方法:体外分离培养增生性瘢痕成纤维细胞,分别将一定浓度的Angll(10-9-10-51/L),和AngII10-6mmol/L加上
2、不同阻滞剂losartan>PD123319、环胞素A(浓度均为10-5mmol/L)入细胞培养液中刺激48h,分别采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Westernblot印迹方法检测增生性瘢痕成纤维细胞纤维连接蛋白(FN)的mRNA及蛋白表达。结果:体外成功地培养增生性瘢痕成纤维细胞。经Angll刺激48h后,FNmRNA和蛋白表达量明显增高,增高程度与Angll浓度呈正比;加入losaartan和环胞素八后,FN原mRNA和蛋白表达量较单用Angll组卜'降,而加入PD123319后,FNm
3、RNA和蛋口表达量较单用Angll组无明显改变。结论:AngIIuj促增生性瘢痕成纤维细胞的FN合成,可能在增生性瘢痕的发展过程中起重要作用,该作用主要通过Angll的I型受体介导完成,该作用可能与CaN信号通路有关。增纶性瘢痕是以成纤维细胞过度增殖和细胞外基质过度沉积为主耍特征的结缔组织疾病。其发病机制至今尚未彻底阐明。血管紧张素II(angiotensinILAnglI)作为肾素一血管紧张素系统中重要的因子,其经典作用是引起血管收缩和调节水盐平衡。近来研究认为,Angll作为一种生长因子,是一种强
4、烈的促有丝分裂原,在促进心肌间质、肾脏间质、肺间质以及血管壁纤维化的过程中发挥重要作用。纤维连接蛋白(fibronectin,FN)为一种大分子非胶原糖蛋白,是细胞外基质的重要成分。本研究通过体外实验,观察Angll及其受体拮抗剂、CsA对成纤维细胞合成FN的影响。1材料和方法1.1主要试剂:Angll(美国Anaspec);Losartan>PD123319>csA(美国sigma);大鼠抗人FN抗体(美国Neomarkers);兔抗大鼠IgG(北京中杉);DMFM培养基(美国Hyclone);胎牛
5、血清(美国Hyclone):医用净化工作台(苏州净化设备公司YJ-875型);C02培养箱(美国SIIEL—LAB1815TC型)。1.2取材标准:①增生性瘢痕,瘢痕色泽红,质硬,高出皮肤表面,均为烧伤创面愈合已超过3个刀,但瘢痕仍持续增生,瘢痕局部无感染和溃疡,均未曾使用抗瘢痕药物、弹力加压、放疗等方法治疗;%1病人无高血压、肝硬化、肺纤维化、慢性肾炎、心肌梗塞等疾病;%1病人无全身感染、肿瘤;④无结缔组织疾病或可能影响结缔组织代谢的疾病,未进行过全身应用皮质类I古I醇等药物治疗。1・3成纤维细胞分
6、离、培养:采用组织块法进行原代培养,将手术中切下的符合条件的增生性瘢痕在无菌条件下切除其表皮,在少量胎牛血清屮将标本切成lmrn3左右的组织块置于培养瓶中,在95%空气、5%C02、37°C、饱和湿度条件下培养6-8h,使组织块牢固的粘附在瓶壁上,然后加入含10%胎牛血清的DMEM培养基适量,继续培养,3-4天换液1次,2-3周后,原代细胞生长成单层,用0.25%胰蛋白酶消化后,按1:3的比例传代培养,此后每2-3天换液1次,每4〜5天分种传代1次,实验用第3-5代细胞。1.4实验分组:实验分为四组:
7、①对照组:10%胎牛血清的DMEM培养液;②AngII组:培养液中加入AngII,浓度范围(10-9mol/L-10-5mol/L);③AngII+洛沙坦(losartan)组:培养液中同时加入AngII(10-6mol/L)合losartan(10-5mol/L);④AngII+PD123319组:培养液屮同时加入AngII(10-6mol/L)和PD123319(10-5mol/L);⑤AngII+CsA组培养液中同时加入AngII(10-6mol/L)合CsA(10-5mol/L)。1.5逆转录
8、聚合酶链反应(RT-PCR)检测FN的mRNA的表达:选取生长较好的成纤维细胞,采用Trizol法提取细胞的总RNA,用紫外分光光度仪测量总RNA的浓度和纯度,-80°C保存。按照试剂盒操作说明,根据FN的相应基因序列合成引物,逆转录为cDNA,PCR法扩增。FN的引物设计:上游引物序列:5’—GATGTGATGTCGATTCCAT_3'下游引物序列:5'-GATCTCTGGTCCATGAAGAT-3',扩增片段为1107bp。内参照B-actin引物上
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