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《有限稀释CR法筛选噬菌体cDNA文库解决策略》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、有限稀释CR法筛选噬菌体cDNA文库解决策基因克隆是基因工程和分子生物学研究的基础，随着2世纪生物技术的快速发展，基因克隆技术越来越多被广泛应用[-2]o976年，Hofstetter等通过杂交质粒的方法第一个成功构建cDNA文库[3]以来，cDNA文库构建和筛选日益成熟并普及，并成为基因克隆及功能基因组研究的基本技术[4-5],是最普遍、最经典的克隆全长基因序列的基本方法之一。传统的筛库方法以标记核酸探针技术为基础，其优点在于准确性和灵敏度高，缺点是放射性标记探针容易造成污染且同位素半衰期短不稳定，非放射性标记探针以生物素和地高辛为基础，成本高且所需工作
2、量大。以CR为基础筛选cDNA文库的方法具有快捷、灵敏等特点，备受广大科研工作者青睐，如杨晓明等以CR介导的cDNA文库矩阵排列法进行混合基因组文库筛选、瞿文全等建立SSS(subsectionscreening)筛选cDNA文库的方法、王志成等基于96孔板CR法筛选cDNA文库[6-8],等等。本研究尝试构建一种以CR为基础，结合有限稀释法筛选cDNA文库的方法，在能够快速有效分离出目的基因的基础上，减少筛选cDNA文库的工作量。材料与方法材料&lambda；噬菌体cDNA文库筛选使用由新疆石河子大学生命科学学院构建并保存的中国美利奴羊混合组织cDNA文
3、库,宿主菌株为XL-BlueMRF,hagemidExcision所用菌株为XLOLR,均含四环素抗性。cDNA文库构建及宿主菌株来自ZAExpresscDNASynthesisKit试剂盒，购自Stratagene公司。2试剂LB液体和固体培养基、LBbrothwithsupplementsNZYAgar,NZYTopAgar、5×；NZYBroth、SM溶液、卡那霉素、四环素，均购自索莱宝公司；ITG和X-Gal,购自科C17JI琼脂粉、琼脂糖、低熔点琼脂糖、MgS04,均购自Amresco公司；其余分子生物学试剂均为国产。3引物利用GenB
4、ank中公布的绵羊[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]预测基因EST序列，用SeqMan软件对EST序列拼接去载体，获得目的序列。将确定好的[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]基因序列，利用比较基因组学方法，比对寻找3&prime；和5&prime；-UTR区域内的高度保守序列，使用remierrimer50软件和NCBI上rimer-Blast工具设计特异性引物，并提交北京华大基因生物工程技术服务有限公司合成。4CR反应条件采用天根2×；TaqCRMasterMix试剂盒，CR反应体系为:O&time
5、s；CRbuffer,25&mu；L；25mmol/LMgC12,20&mu；L；0mmol/LdNTMix,05&mu；L；0&mu；mol/L正、反向引物，各&mu；L；模板，2&mu；L；Taq酶，U;ddH20,补至25&mu；Lo反应条件为：94°C预变性5min；94°C变性45s,60°C退火45s,72°C延伸90s,30次循环；72°C延伸8minoCR反应结束，用％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外凝胶成像仪观察并照相保存。5&lambda；噬菌体cDNA文库筛选&lambda；噬菌体cDNA文库筛选流程见图。5宿主菌的制备用接种环蘸取XL
6、-BlueMRF&prime；菌液在含有四环素终浓度为2&mu；g/mL的LB平板上划线，379过夜培养；用接种针在平板上挑取个单菌落，于20mLLBbrothwithsupplement中30°C、220r/min振荡过夜培养；培养菌液000g离心5min,弃上清，加入0mmol/LMgS04溶液将菌株细胞重悬稀释调至D600nm值为06〜0,4。（2保存备用oXLOLR菌制备过程与XL-BlueMRF&prime；相同。52&lambda；噬菌体cDNA目的基因确定取&lambda；噬菌体cDNA扩增文库菌液2&mu；L进行CR检测。53&lambda
7、；噬菌体cDNA扩增文库的第轮有限稀释筛选根据CR检测结果能够获得特异性条带，将此扩增文库菌液E管编号0；另取0只5mLE管并编号〜0号管，加入00&mu；LLBbrothwithsupplement培养基，依次从各管中取00&mu；L培养菌液，反复吸打充分混匀，进行有限稀释；取有限稀释的各管菌液4&mu；L进行CR检测，如〜0号管CR检测中〜9号管有特异性条带，而0号管无，则选取9号管为最大稀释倍数的阳性管。[FL)][FK(W7][TZLtif][FK)][FL(2K2]54最大稀释倍数阳性管的培养吸取最大稀释倍数的阳性管噬菌体cDNA扩增文库溶液4&
8、mu；L与400&mu；LXL-BlueMRF&prime；宿主菌
