安徽桑树品种全基因组DNA提取方法探究

《安徽桑树品种全基因组DNA提取方法探究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、安徽桑树品种全基因组DNA提取方法探究o引言中国是蚕桑生产的发源地，拥有极其丰富的桑树种质资源。随着分子生物学技术的快速发展，从分子水平上对桑树种质资源的遗传变异进行研究已成为桑树分子生物学研究热点之一。向仲怀等⑴运用RAPD技术构建了桑属9个种的DNA指纹图谱，对桑属的植物分类进行了开创性的研究，开辟了中国分子标记技术研究桑树种质的先例。基因组DNA的提取是进行分子标记技术研究的关键步骤之一，高质量基因组DNA的获取是进行桑树生物学方面研究的基础。由于桑树是多年生木本植物，组织细胞含有大量的多糖、多酚、酯类等复杂次生代谢产物，因而要从中提取高质量的DNA有较大困难[2-5]o本实验

2、采用十六烷基三甲基漠化镀(CTAB)法对安徽特色桑树品种的嫩叶进行DNA的提取在实验过程中优化了DNA提取程序，获得了高得率、高纯度的DNA,能成功地应用于后续的分子生物学反应。旨在为桑树基因组DNA的研究提供理论与技术参考，也为进一步深入开展其亲缘关系分析、基因组比较、遗传多样性分析等分子生物学研究提供一定的基础资料。1材料与方法1.1实验材料选取5种安徽桑树地方品种(样本采自安徽省农业科学院蚕桑研究所桑树品种选育中心“以桑嫩叶为实验材料，品种分别为：金寨九龙桑、皖桑1号、红星5号、皖花桑、7707。1.2DNA提取方法桑树基因组DNA提取采用CTAB法，参照赵卫国［2］的方法，稍

3、加改进。①取0.1~0.2g嫩叶剪碎，在液氮条件下磨碎成粉末，转入经559预热的600μL的CTAB提取缓冲液(0.1mol/LTris-HCI,pH8.0,0.02mol/LEDTA,1.4mol/LNaCI,2%CTAB,1%PVP,0.04mol/Lβ-疏基乙醇）中；②混匀后在659水浴裂解30min，期间轻摇数次以混匀，室温冷却，12000r/min离心15min;③加入500μL氯仿:异戊醇(24:1),抽提细胞残渣和叶绿体，轻轻颠倒混匀至乳白色；常温13000r/min离心10min;④转移上清液到新离min;⑤常温下，10000r/min高速离心5

4、min,弃上清后倒心管中，加入等体积的预冷的异丙匀，室温静置3〜5置干燥，加500μLddH20溶解；加入2μLRNase(10mg/mL),37°C水浴1h;⑥加等体积酚抽提1次,酚氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提1次，氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次；⑦加2倍体积无水乙醇沉淀DNA,轻轻混匀，-20°C过夜；⑧13000r/min离心10min,弃上清，用70%无水乙醇洗涤DNA2次，每次8000r/min离心10min;倒置干燥后加入200μL的TE缓冲液(10mmol/LTris-HCIpH8.0,1mmol/LEDTApH8.0)溶解DNA,样品保存于4

5、9或-20°Co1.2DNA质量检测方法1.3.1D(λ)法DNA完全溶解后，吸取5μLDNA溶液，加95μLTE,稀释100倍后，在DU-70紫外分光光度计上测定OD260和OD280值。1.3.2电泳分析取DNA样品3μL与1μL6×Loadingbuffer混匀,在4%琼脂糖凝胶(含EB)上电泳检测DNA质量，反应混合物在1×TAE缓冲液中120V电泳30mino电泳结果在Tanon(Gis-2008)凝胶成像系统拍照。1.3.3PCR分析参照文献⑹设计扩增引物ITS5(5´・GGAAGTAAAA

6、GTCGTAACAAGG・3´)和ITS4(5´・TCCTCCGCTTATTGATATGC・3´)oPCR反应体系总体积25μL:2*MasterMix12.5μL;模板DNA1.0μL;引物各1.0μL(浓度为10ng/μL);ddH2011.5μLoPCR扩增程序如下：95°C预变性5min;95°C变性30s,60°C退火1min,72紇延伸1min,35个循环；729延伸5min;PCR产物于49保存。2结果与分析2.1DNA样品纯度及得率5种样品A260/A280比值均在1.80

7、-1.90之间。说明以桑嫩叶为材料所提取的5种DNA样品中蛋白质、植物色素、多糖和酚类物含量较低，DNA的得率和纯度均较高，能够满足进一步分子生物学操作的需要。2.2DNA样品的电泳琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取到的DNA总带清晰整齐，无杂带、无拖尾现象（图1）,表明DNA提取纯度较高。2.3DNA的PCR分析提取DNA进行PCR分析，结果显示能够获得清晰稳定的产物条带（图2）,说明提取的DNA完全可用于PCR分析，可为桑树的后续分子生物学实验操作奠定基础。