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《含抗凋亡基因bcl-2重组逆转录病毒重组体的构建及鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、含抗凋亡基因be1-2重组逆转录病毒重组体的构建及鉴定【摘耍】耳的：构建并鉴定含鼠bcl-2基因重组逆转录病毒。方法：将抗凋亡基因bcl-2片段从载体pcDNA3.1中切下，定向插入逆转录病毒载体PLNCX244,酶切鉴定；脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定表达bcl-2的细胞株。结果：双酶切鉴定，成功构建重组逆转录病毒载体；重组逆转录病毒转入包装细胞PT67,经G418筛选，形成了抗性克隆，并测得病毒滴度为3X1011cfu/L,提示构建的含鼠bcl-2基因重组逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论：含抗凋亡基因bcl-2
2、重组逆转录病毒载体构建成功。【关键词】逆转录病毒载体重组bcl-2基因0引言随着一些常见致盲眼病已有较好的防治措施，难治性或不可治性眼病已成为眼科研究的热点和焦点。难治性眼病主要是指一些累及视网膜的变性性疾病，如遗传性视网膜变性、老年性黄斑变性、视网膜色素上皮细胞（RPE）和锥杆（光感受器）细胞的渐进性变性死亡，迄今尚无防止这些细胞变性死亡的有效方法。我们构建抗凋亡基因bcl-2重组逆转录病毒，将其导入培养的正常的SI）大鼠RPE细胞，然后将其显微注射入视网膜色素变性鼠的视网膜下腔，对视网膜变性性疾病基因治疗进行探索性研究，为构建并鉴定bcl-2基因重组逆转录病
3、毒的工作报道如下。1材料和方法1.1材料PLNCX2逆转录病毒载体和包装细胞系PT67为第二军医大学微生物教研室潘卫提供，含鼠bcl-2基因的pcDNA3.1（酶切位点（KPnI+Xbal））由屮国科学院细胞生化所刘新垣教授惠赠，质粒提取试剂盒和DNA纯化回收试剂盒均购于上海博彩生物科技有限公司；T0P10F'和DH5a大肠杆菌菌株由微生物教研室提供，以CaC12方法制成感受态细胞；各种限制性内切酶及PMD18T载体购丁TaKaRa宝生工程（大连有限公司）；NIH3T3细胞、脂质体及G418均购口Clontech公司；琼脂糖及各种生化制剂购于上海华舜生物工程公司
4、产品。1・2方法①pcDNA3.1（bcl-2）的扩增:将小鼠pcDNA3.1（bcl-2）质粒用CaCL2方法转入大肠杆菌TOP1OF7菌株中，LB培养基扩增，碱裂解法提取质粒DNA,并用Wizard质粒提取试剂盒加以纯化质粒DNA。②设计和合成引物（带有HindHI和StuI两酶酶切位点），上游57-ATAAAGCTTATGGCGCAAGCCGGGAGA-37（含HindHI酶切位点），下游5’-TATAGGCCTTCACTTGTGGCCCAGGTA-3'（含Stu1酶切位点），由上海生工生物工程公司合成。（3）PCR扩增：50nL体系中，模板DNAluL,
5、dNTPlPL（200umol/L）,引物上游5'-ATAAAGCTTATGGCGCAAGCCGGGAGA-37（含HindHI酶切位点），下游5’-TATAGGCCTTCACTTGTGGCCCAGGTA-37各1uL（25pmol）,TaqBuffer5uL,Taq酶luL,在PCR仪（2400型，美国PE公司）扩增，94°C5min后94°C30s,55°C30s,72°C50s,35循环，72°C7min,4oC10mino扩增PCR产物序列分析扩增得到的DNA电泳，低融点胶回收纯化。按Promega操作手册连接插入pGEM-T载体后转化到感受器DH5a大
6、肠杆菌中，筛选出含有bcl-2冃的基因质粒的菌落，提取酶切鉴定后，命名为pGEM-bcl-2o将所选出含有目的基因质粒的大肠杆菌送上海基康公司进行测序。用限制性内切酶Hindlll和StuI酶解质粒pGEM-bcl-2,电泳、低融点胶回收小鼠bcl-2DNA片段（0.7kb）,溶解于TE中,-20°C保存。逆转录病毒载体PLNCX2,用限制性内切酶HindITI和StuI酶切后去磷酸化，pGEM-bcl-2经同样酶切后分离出0.7bpbcl-2全部编码区片段，在T4DNA连接酶的作用下与载体连接、转化，以及用快筛法筛选出基因重组子PLNCX2—bcl-2。转染包
7、装细胞系PT67复苏包装细胞系PT67,在完全培养基（含小牛血清）培养中，在转染前12〜24h,将PT67细胞系接种于60mm的培养皿中，当细胞生长至60%〜80%融合时，加入预先准备好的转染混合液于37°C,C02孵育箱中培养24h,其屮包括重组逆转录病毒载体质粒100uL和空载体100uL（均为质粒5ug,脂质体30ug,用无血清培养液稀释而成）；次日更换新鲜的完全培养基，于转染72h后，吸出培养基，PBS洗涤细胞2次后重新加入5mL完全培养基，继续培养48h,以提高病毒滴度。将转染后的包装细胞按照1：20的比例传代于含G418(300)的选择培养基培养3d
8、,更换为G418(400
