乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定

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1、乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定—L(-)-耗脯氨酸含量测定法1主题内容与适用范围木方法规定了乳与乳制品制品中L(-)-n脯氨酸含量的测定方法。本方法适用于乳少乳制品中LH-轻脯氨酸含量的测定。本方法通过对L(-)脯氨酸含量的测定，可判定是否为动物水解蛋口。2引用标准GB9695.23-90肉与肉制品L(-)-疑脯氨酸含量测定3原理试样经酸水解，释放出梵脯氨酸。经氯胺T氧化，生成含有II比咯坏的氧化物。用高氯酸破坏过量的氯胺To轻脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物,在波长558nm处进行比色测定。4试剂所用试剂均为分析纯，水为蒸馆

2、水或同等纯度的水。4.1氯化亚锡(GB638):0.75%溶液。将氯化亚锡7.5g溶于500mL水中，再加入500ml浓盐酸(GB622)。4.2盐酸(GB622):6mol/L溶液。4.3氢氧化钠(GB629);lmol/L、10mol/L溶液。4.4缓冲液:将50g柠檬酸,26.3g氢氧化钠和146.lg结晶乙酸钠(GB694)溶于水，稀至1L,此溶液打200mL水和300mL止丙醇混合。4.5氯胺T(HG3-972)溶液:将1.41g氯胺T,溶于lOinL水中，依次加入10mL正丙醇和80mL缓冲溶液(用时现配)。4.6显色剂:称取10g对二甲氨基苯甲醛，用35

3、niL高氯酸(GB623)溶解，缓慢加入65n)L异丙醇。4.7L（-）-泾脯氨酸（C5H9N03）标准溶液。4.7.1标准储备液500ug/mL:称取50.0mg/L（-）-瓮脯氨酸用少量水溶解，加一滴6mol/L盐酸,定容至100皿容量瓶中。4.7.2标准工作液5ug/mL:吸取标准储备液5.OOmL于500mL容量瓶中，定容。5.1实验室常规设备。5.2配有冷凝管的三角瓶:250mLo5.3恒温水浴。5.4试管加热器或水浴，可控温于60°Co5.5分光光度计。6试样处理：6.1方法1：准确称取样品2-5g（液体样品5-10g）放入250mL磨口三角瓶屮。加几粒沸

4、石。加入氯化亚锡溶液lOOmL,置于水浴上加热回流16h。趁热将水解溶液过滤于200mL容量瓶中，用6moL/L热盐酸10mL反复三次冲洗三角瓶和滤纸，冷却，用水定容到刻度，混匀。吸取5〜25mL（Vl）水解液于1OOmL烧杯中，用10mol/L、lmol/L氢氧化钠溶液调节pH为8±0.2,过滤于250mL容量瓶中，用30mL水冲洗烧杯和滤纸上的氢氧化亚锡沉淀，反复三次，把洗液并入滤液中，以水洗至刻度，摇匀备用。6.2方法2：准确称取一定量样甜，精确到0.0001go使样甜蛋口质含量在10〜20mg范围内；将称好的样品放于水解管中。在水解管内加6mol/L盐酸10〜

5、15讥（视样品蛋白质含量而定）或加入12mol/L盐酸10〜15mL,含水量高的样品（如牛奶）可加入等体积的浓盐酸，加入新蒸憎的苯酚（3.3）3〜4滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3〜5min,再接到真空泵的抽气管上，抽真空（接近0psi）,然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在110±l°C的恒温干燥箱内，水解24h后（如加入12mol/L盐酸，水解时间可缩短至6h）后，取出冷却。打开水解管，趁热将水解溶液过滤于100mL三角瓶屮，用6moL/L热盐酸10mL反复三次冲洗试管利滤纸，冷却，用水定容到刻度,混匀

6、。吸取5〜25mL（Vl）水解液于lOOmL三角瓶中,用10mol/L^lmol/L氢氧化钠溶液调节pH为8±0.2,过滤于50mL容量瓶屮，用水冲洗烧杯和滤纸上的氢氧化亚锡沉淀，反复三次,把洗液并入滤液屮，以水洗至刻度，摇匀备用。7分析步骤7.1测定7.1标准曲线的绘制吸取L(-)-轻脯氨酸标准工作液0.00,10.00,20.00,30.00,40.OOmL,分别置于100mL容量瓶中，定容摇匀。浓度分别为0.0,0.5,1.0,1.5,2.0ug/mLo取不同浓度的上述溶液4.OOmL,分别加入20mL具塞试管中,加氯胺T溶液2mL,摇匀后于室温放置20mino

7、加入显色剂加L,摇匀，塞上塞子于60°C试管加热器(或恒温水浴)中保温20min后取出，迅速冷却,在波长558±2nm处测定吸光值，绘制标准曲线。7.2试样测定从待测液屮吸取已制备好的样液4.OOmL于20mL具塞试管屮，以下按7.1步骤进行，同时作空口试验。8分析结果的计算C・V1・A计算公式：x=X100mX1000式屮:X——样品屮L(-)脯氨酸的含量，％;C——从标准1111线上查得相应的L(-)-轻脯氨酸量，ug;m——称取试样的质量,g；VI样液体积,mLoA——稀释倍数当符合允许差所规定的要求时，取两次测定结果的算术平均值作为结果，结果