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1、传统乳制品中降胆固醇作用乳酸菌分离探究摘要：文章从中国传统乳制品中分离得到5株乳酸菌纯菌株。通过邻苯二甲醛法测定了每株菌株对培养基中胆固醇的降解能力，其降解率分别为18.4%、50.2%、15.4%、26.9%.24.1%O并通过对降解率最高的菌株L2进行了形态观察、生理生化实验、鉴定及16SrRNA序列分析等研究，鉴定其为干酪乳杆菌。关键词：中国传统乳制品；降胆固醇作用；乳酸菌中图分类号:S571文献标识码：A文章编号:1674-0432(2011)-06-0097-21材料方法1.1材料1.1.1
2、样品采集本研究的乳制品样品均采集于内蒙古海拉尔地区的牧民家庭中。将采集到的传统乳制品保存与灭菌管中，低温运回实验室，置冰箱备用。1.1.2仪器Olympus光学显微镜，超净工作台、厌氧培养箱、Eppendorf全自动高压灭菌锅、梅特勒电子天平、吉尔森移液器、Eppendorf冷冻离心机、GeneQuantlOO紫外分光光度计、1.1.3主要试剂及配制方法胆固醇、溶菌酶、蛋白酶K、Taq酶、dNTP；16SrRNA引物合成于英潍捷基贸易有限公司;MRS培养基参照《常见细菌系统鉴定手册》中所提供的方法进行
3、配制。MRS-CHOL高胆固醇培养基的配制方法：准确称取l.Og胆固醇，溶于lOOmL无水乙醇中，此时，溶液浓度为10.0g/Lo向lOOmLMRS液体培养加入ImL10.Og/L的胆固醇溶液，胆固醇在培养基中的最终浓度约为100mg/Lo1.2方法1.2.1中国传统乳制品中乳酸菌的初筛将采集的传统乳制品样品于MRS固体培养基平板上划线，置厌氧培养箱中,37£培养48h。挑选出不同形态的菌落重复划线，于37°C厌氧培养箱中培养24h,重复几次，直至分离得到纯化的乳酸菌。将纯化的乳酸菌菌株穿刺接种在MR
4、S半固体培养基中，37°C厌氧环境下培养24h,保存于4°C备用。1.2.2降胆固醇乳酸菌的筛选胆固醇含量的测定采用邻苯二甲醛法［5］。将分离得到的纯菌株分别接种与MRS培养基中活化2-3代，取ImL菌液接种于5mLMRS-CH0L培养基中，摇匀后立即离心，取上清测定胆固醇的含量。然后混匀,将其置37工厌氧培养箱中培养24h,离心，取上清测定胆固醇的含量。将同一株纯化菌株同时做10个平行实验，求该菌株的胆固醇降解率的平均值。胆固醇的降解率二（对照组胆固醇的含量-发酵后胆固醇的含量)/对照组胆固醇的含量
5、。1.2.3降胆固醇乳酸菌的生理生化实验镜检观察具有胆固醇降解作用的乳酸菌的菌体形态，观察平板培养菌落的形态，进行革兰氏染色和触酶实验，对菌株进行初步鉴定。将该菌株接种于糖发酵管中，37£厌氧培养24h后观察实验结果，对该菌株的属、种进行鉴定。1.2.416SrRNA的分子鉴定提取筛选到的具有胆固醇降解作用的乳酸菌的基因组DNA,以其为模板，利用细菌16SrRNA的通用引物(ForwardPrimer：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；ReversePrimer：5’-AAGGAG
6、GTGATCCAGCC-37)进行PCR扩增。扩增体系见表1oPCR扩增的反应条件：94£预变性3min,94*变性30s,53°C退火30s,72°C延伸60s,30个循环后，72°C延伸lOmin,QC保存。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并委托天一辉远生物科技有限公司测序。测得序列在NCBI上进行BLAST,与GenBank中的乳酸菌标准株的16SrRNA序列进行同源性比对。2结果与分析2.1中国传统乳制品中乳酸菌的初筛结果经过划线纯化，本研究从中国传统乳制品中筛选到5株纯化的乳酸菌菌株，
7、分别命名为LI、L2、L3、L4、L5O2.2降胆固醇乳酸菌的筛选结果5株乳酸菌都具有一定的降胆固醇能力，但是菌株之间差异较大。对照组的胆固醇含量为95.3mg/L,LI、L2、L3、L4、L5的发酵上清中平均胆固醇含量分别为77.8mg/L.47.5mg/L.80.6mg/L、69.7mg/L、72.3mg/L,降解率分别为：18.4%、50.2%、15.4%、26.9%、24.1%。其中，菌株L2的降胆固醇能力最强，降解率达到50.2%,在10次重复实验中，数据没有较大的波动，活性比较稳定。2.3
8、菌株L2的形态和菌落特征该菌株革兰氏染色结果呈现阳性，镜检观察菌体为杆状，单个或链状排列。菌落直径为0.5-1.0mm,边缘整齐，表面光滑，呈乳白色。初步鉴定该菌株为乳酸杆菌属。2.4菌株L2的生理生化实验结果经生理生化实验鉴定，菌株L2与干酪乳杆菌的性质相近。菌株L2的生理生化实验结果见表2。2.516SrRNA鉴定结果1%的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增得到约1500bp的片段，如图1所示。将测序的核昔酸序列与GenBank中的标准株序列进行比对，发
