RNA提取策略及RTPCR技术

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1、RNA提取策略及RT-PCR技术第一部分RNA提収策略1、RNA降解的原因内源性RNAase是造成RNA降解的最重要原因,因为人体细胞自身就是几十分钟（20min?）mRNA被降解-轮，所以不管是组织还是细胞还是液体状样本在离开其中细胞的最佳生活状态后都应该尽快的被妥善的方法保存起來。外源性RNA嗨也是一个需要注意的因素，最常见的就是毛发尤其头发，灰尘，唾液，梨料于套这四个兄弟。针对它们我们应该戴帽子，口罩，橡胶无菌乎套，在淸洁灰尘少的地方提取RNA,我上而说了内源性RNAase污染才是关键，所以

2、冇些同志没冇注意这些对外源性RNAase的防护RNA也提取的很出色。但是如果你运气不太好的话外源性RNAase污染影响很人的。2、样品的取材我们抽提RNA往往都是需要其mRNA,而mRNA的表达昴和细胞或者组织的生长状态息息相关，我们収组织块应该避免収到坏死组织，而细胞我们应该在其处于生长旺盛的时期收集（贴壁细胞消化要迅速，离心要稍为快些，英至可以不消化下來直接进入裂解步骤；此外还可以采取先虑荡敲击培养瓶的方法使细胞和培养瓶的结合卜-降，然厉用吸管吹打培养基地方法把细胞吹打下來，这样细胞的代谢不会

3、明显的受到抑制。注意在平时传代的时候就耍注盘观察细胞除了用胰酶消化下来以外是否还有其他比较简单的方法）（此外还可以把培养液倒掉后迅速的加入裂解试剂开始抽提RNA）。3、待提取样品保存方法这些保存方法温度从4度到零下196度不等，选择哪一种保存方法关键是耍对这些保存方法的优缺点有淸醉的认识。根据你需耍的RNA种类可以做简单的分类。包括RNA病蒔RNA,mRNA（各种）,rRNA等其中最容易降解或者破坏的就是mRNA,最不容易损失的就是RNA病毒RNA（冈为冇蛋口壳保护）。超低温保存：特指液氮保存不管

4、纽织还是细胞如果需要其中的mRNA必须在液氮中保存，・70度等方法都是错误的方法，在很短的时间内或许町以，但是长期是不町能的。・2070摄氏度保存：RNA病毒的RNA可以在这个温度段安全的保存。但是其产生的mRNA还是必须超低温保存。4度保存：有特殊的保护试剂存在地情况F组织的保存：应该是离体后在lmin内就放入液氮或者保护试剂中。山于捉取RNA对组织块冇一定駅的要求，大约100mg居多（脂肪细胞需要的量多的多，因为细胞是大大膨胀的），所以在取材前就需要明确到底你需要的组织大概多大是lOOmg,令

5、少勿多。如果是取临床的标本，就应该带上液氮縮子，DEPC处理的器械，锡箔纸，线等在手术室外答候，标本一切下就尽快进行切割（大概lOOmg-块），包装（锡箔纸内），捆扎（方便在液氮讎子中寻找），迅速丢入液氮罐子中，最好是lmin内完成（所以大家取材前一定要好好联系一下，不要到时候手忙脚乱的人_人）细胞的保存：比较麻烦些，所以大多都是直接捉取RNA再保存。建议离心收集后用特殊保护试剂匝悬后保存。4、RNA提取提取RNA可以分为总RNA,mRNA,VirusRNA（RNA病毒）儿类TrizolR卩异硫氟

6、酸呱•苯酚法,这种方法的原理是：首先用强变性剂异硫亂酸肌裂解细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性，釋放出核酸。释放出来的DNA和RNA由于在特定pH时溶解度不同，分别位于整个体系中的中间相和水相，从而使DNA和RNA分离开來。进一步通过冇机溶剂來抽捉沉淀RNA,就可以得到纯净的RNA；TrizolMV-是MRC实验來的科沖家发明的方法，后來把专利卖给了invitrogen/Gibco,invitrogen/Gibco将此方法推广到世界。他的trizol曾经由其他公司OEM制作，现在已经自己生产。本

7、來Trizol是一个专利的品牌，但是国内也有不少仿制的品牌，基木的原理是-•样，配方稍有不同。RNeasykit：Qiagen的王牌产品，号称适用于各种RNA抽提,其实在特殊的组织比如大脑，肌肉，脂肪组织还是选择特殊抽捉试剂为佳。此外细菌RNA抽提也最好使用专用抽提试剂盒。这些产品Qiagen都提供。注意凡是Qiagen的试剂盒抽提应该是没冇5S带的，因为它将5S破坏掉了。其他的比如roche,promega等都很好的是的。尤其promega性价比最高!注意各种方法对于组织都需要先臓磨，应该用陶瓷

8、碾磨器，同时一定要在碾磨同时不断的加入液氮。（少数牛人号称从來不加液氮也提取的很好，我只能说他运气实在不错）。特殊的RNA抽提试剂盒-mRNA抽提试剂盒：单纯的抽提mRNA的试剂盒很少见到有人在使用，但是其具冇一般RNA抽提试剂盒没冇的优点，在一些实验中冇出奇致胜的效果，推荐promega的总RNA捉取KIT,效果与Qiagen差不多，价格便宜多了，性价比最高的好东东！试剂盒提取的其优点有以下儿点：1、提取得mRNA纯度高，因为对于很多实验rRNA其实也是一种污染，我们只想RT我们