总rna的提取和rtpcr课件

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1、实验总RNA的提取与RT-PCR南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心http://jpkc.fimmu.com/sfzx/完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。掌握从细胞中提取总RNA的方法掌握RT-PCR基因扩增的原理和操作方法目的实验流程提取原理操作步骤逆转录原理操作步骤提取总RNA合成cDNA第一链原理体系引物选择PCR电泳原理电泳步骤电泳第一部分细胞总RNA的提取操作步骤1.匀浆化作用8000rpm离心2min收集细胞，弃上清；加入500uL的TRIpure,用振

2、荡器震荡至无明显沉淀,室温静置5min.2.分离阶段向匀浆样品中加入0.1mL氯仿，剧烈震荡15s，室温下孵育2-3min，12000g离心15min，吸取上清至新Ep管。3.RNA的沉淀向上清中加入0.5mL异丙醇，上下颠倒混匀,室温孵育10min，12000g离心10min，弃去上清液，可见胶状沉淀。4.RNA的漂洗加500微升75％乙醇洗涤沉淀一次，轻轻上下颠倒洗涤，12000g离心5min,弃去乙醇.5.RNA的再溶解空气干燥RNA沉淀，注意不要完全干燥，加入10uLRNase-Free处理水，充分溶解。原理10-5mgRNA/细胞mRNA3’端存在20-250个多聚腺苷酸(po

3、lyA)结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。RNA分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。rRNA80-85%：28S18S5StRNA,snRNA10-15%mRNA1-5%原理：Trizol的主要成分Trizol是一种新型总RNA抽提试剂主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此T

4、rizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。原理仪器和主要试剂1.微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管2.TRIpure试剂3.氯仿4.异丙醇5.75℅乙醇6.无RNase的水(溶液均需用DEPC处理过的水配制)所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源ＲＮＡ酶的有效抑制；有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有

5、效除去。关键点RNA酶污染来源RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。防止RNA酶污染的措施所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾

6、干。配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。RNA完整性检测完整的RNA的电泳可明显地观察到28S和18S两条带，并且28S大约是18S的两倍宽。若两条带不明显,则说明RNA部分降解,可能的原因是污染了RNase。RNA降解A.组织取出后没有马上处理或冷冻。B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。C.细胞在用胰酶处理时过度

7、。D.溶液或离心管未经RNase去除处理。E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5。DNA污染A.样品匀浆时加的试剂量太少B.样品中含有有机溶剂(如乙醇，DMSO等)，强缓冲液或碱性溶液常见问题分析第二部分逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)仪器和主要试剂基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管总RNA第一链cDNA合成试剂盒（含有逆转录