果蝇总RNA和总蛋白的提取及分析.doc

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1、果蝇总RNA和总蛋白的提取及分析摘要：本次实验主要分为两大部分。第一部分是以果蝇成体为材料，通过Trizol试剂直接从果蝇细胞或组织中提取总RNA，然后进行反转录制备cDNA，最后通过琼脂糖凝胶电泳来测定总RNA和cDNA的纯度，进而来进行分析。第二部分仍以果蝇成体为材料（有的小组是果蝇幼体），提取果蝇总蛋白，通过SDS-PAGE检测果蝇总蛋白表达，最后对果蝇的蛋白含量进行了分析。关键字：RT-PCR；cDNA；琼脂糖凝胶电泳；SDS-PAGE1材料及仪器1.1实验材料黑腹果蝇成虫2-3d龄，约6只，雌雄均等。果蝇是一种非常重要的模式生物，通常所指的是黑腹

2、果蝇，学名：Drosophilamelanogaster，在分类学上所属动物界，节肢动物门，昆虫纲，双翅目，果蝇科，果蝇属。果蝇以其繁殖迅速、生长周期短、易于养殖、相对性状丰富、基因组较为简单等显著特点成为了遗传学、分子生物学、发育生物学等重要学科的主要实验动物之一，对果蝇基因组的测序分析也较为透彻，因此，本实验选用果蝇为实验材料，可以使数据更加具有代表性和说服力。1.2试剂及仪器1.2.1试剂Trizol裂解液（50mg/ml），氯仿，异丙醇，75%乙醇，RNasefreeH2O，琼脂糖，TAE电泳缓冲液，DNAmarker，ddH2O，10×PCRBu

3、ffer（含Mg2+），dNTP（10mMeach），引物：rp49F、rp49R；CG8189F、CG8189R，TaqDNApolymerase（2U/µl），TBS缓冲液（20mMTris-HCl，150mMNaCl,pH7.9），蛋白上样缓冲液，染色液，脱色液1.2.2器材1.5ml离心管，匀浆棒，高速台式离心机，200µl及1ml微量移液器及吸头，天平，量筒，锥形瓶，微波炉，制胶板，电泳槽，电泳仪，凝胶成像仪，PCR仪，水平摇床等。2实验方法及步骤2.1果蝇总RNA的提取、反转录过程及RT-PCR2.1.1果蝇总RNA的提取取果蝇成体于1.5ml

4、离心管中，加1mlTrizol（50mg/ml）裂解液后，用匀浆棒匀浆，室温放置5min，使其充分裂解，之后，在4℃条件下12000g离心5min。转移上清至一新离心管中，加入氯仿（200µl氯仿/mlTrizol），振荡混匀，室温放置2min。在4℃条件下，12000g离心15min。取出离心管，小心转移上层水相至新离心管中。加入异丙醇（0.5ml异丙醇/mlTrizol），充分缓慢混匀，室温放置5min。在4℃条件下12000g，离心10min。取出离心管，弃上清，加入1ml75%乙醇，悬起管底沉淀，继续在4℃条件下，7500g离心5min。取出离心管

5、，弃上清，室温干燥RNA沉淀。加入50µlRNasefreeH2O溶解，备用。2.1.2反转录过程以RNA为模板，利用Promega公司提供反转录试剂盒合成了第一链cDNA；（1）取一只DEPC处理过的小EP离心管，向其中加入以下混合液，其体系如下：TotalRNA1µlRNase-freeH2O4µlOligo-anchorR1µl（2）将混合液充分混匀并瞬时离心，置于70°C孵育10min后，立马在冰上冷却2min，再次瞬时离心使得混合液集于管底；（3）冰上继续向管中加入:5×ReactionBuffer5µlRibonucleaseinhibitor

6、（20U/μL）1.25µldNTPMix（10mM）1.25µlM-MLVReverseTranscriptase1µlRNase-freeH2O10.5µl（4）将总反应液轻轻混匀瞬时离心，42°C孵育60min;（5）最终转录产物用ddH2O水稀释适当倍数后作为PCR模板使用。2.1.3RT-PCR在PCR管中加入如下反应体系：ddH2O19.5µl10×PCRBuffer（含Mg2+）2.5µldNTP（10mMeach）0.5µlDNAtemplate（cDNA，1：10）1.0µlTaqDNApolymerase（2U/µl）0.5µl上下游引

7、物各0.5µlPCR程序设定为：94℃2min变性94℃15s退火55℃15s延伸72℃30s72℃5min进行30个循环通过10%琼脂糖凝胶电泳检测cDNA浓度。2.2果蝇成虫总蛋白的提取与SDS-PAGE检测取果蝇成虫约5只，加入200µlTBS缓冲液在匀浆器中匀浆，将匀浆液于4摄氏度条件下1000rpm离心十分钟，取出离心管，吸取上清液16µl，加入4µl蛋白上样缓冲液，沸水浴5分钟。通过SDS-PAGE法检测提取的总蛋白。（1）3实验结果3.1果蝇总RNA检测1234567如上图所示，第2条带是我们组的提取出来的总RNA含量，其中第一条带是Mark

8、er。从条带的亮度可以看出我们组提取的rRNA5s不是很明显，而2