ExoQuick提取人血清外泌体方法改良及比较_王仁峰

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1、CMYK2458实用医学杂志2015年第31卷第15期ExoQuick提取人血清外泌体方法改良及比较王仁峰耿振李朝阳鲍会静李雪周迪苏宋士伟刘运德摘要目的：优化经ExoQuick提取人血清中外泌体（exosome）的方法以获得高质量exosome，并与超速离心法进行比较。方法：分别采用ExoQuick试剂盒及其改良方法、超速离心法提取人血清exosome。利用透射电镜进行形态学观察；2，2－联喹啉－4，4－二甲酸二钠（BCA）法进行蛋白定量；Westernblot检测exosome表面标志物CD63；十

2、二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白表达差异。结果：3种方法均可提取到血清exosome，电镜下观察到圆形或椭圆形膜性囊泡结构；ExoQuick试剂盒法及其改进方法提取所得样本浓度显著高于传统超速离心法（P＜0．05）；SDS-PAGE显示3种方法提取样本蛋白表达强度及丰度存在差异；Westernblot表明3种方法提取exosome均表达其表面特异性标志物CD63，且含同浓度蛋白的情况下，ExoQuick试剂盒法及改良法其CD63含量明显高于传统超速离心法。结论：3种方法均能

3、提取血清中exosome，ExoQuick试剂盒法及改良方法提取exosome效率更高，同时改进方法能够有效地去除提取样品中的杂蛋白。关键词外泌体；超速离心法；ExoQuick试剂盒法；方法改良外泌体（exosome）是具有脂质双层结构的膜1材料与方法源性小囊泡，直径多介于30～100nm。19世纪80年代exosome的概念首次被提出，指由肿瘤细胞系1．1实验样本血清样本来自天津医科大学总医释放，具有5－核酸酶活性的膜性小囊泡，随着对院检验科，共选取体检健康者血清10份。exosome的研究逐步加深

4、，发现其可以由几乎所有1．2试剂及仪器ExoQuickPrecipitation（美国的有核细胞所分泌，如T淋巴细胞、B淋巴细胞、SBI公司）；BCA试剂盒（北京天根生化科技有限公树突细胞、上皮细胞、肿瘤细胞等。最近的研究发司）；鼠抗人CD63一抗（abcam，ab8219）；0．22μm现，exosome也存在于多种体液中，如血液、唾液、一次性滤膜（美国PALL）；炭支架铜网（北京新兴尿液、胸腹水等。exosome内含有不同种类的蛋白百瑞公司）；透射电镜（日本JEOL公司）；超高速冷质、脂质、mRN

5、As、microRNAs、信号分子等具有生冻离心机（美国BeckmanCoulter公司）；高速冷冻物学活性的物质，较易与邻近细胞的细胞膜发生离心机（德国Sigma公司）；酶标仪（美国BioTek公融合，将生物学活性物质选择性地递送至受体细司）；全自动凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。胞，在不同细胞间进行信息传递，调节细胞间的信1．3血清exosome提取实验采用健康人血清进号传导，发挥多种生物学功能。多种疾病，特别是行exosome提取。每份血清分别用ExoQuickPre-癌症患者血清中exo

6、some含量具有明显改变［1］cipitation，但试剂盒及改良方法、传统超速离心法提取其机制研究上不明确，因此获得高纯度、无丢失的exosome（每种方法1．8mL血清），具体流程见图1。exosome样本是进一步探寻其功能机制和组成的1．3．1传统超速离心提取法（A法）血清以300基础。本研究以健康人血清为样本，通过3种方法×g离心10min去除细胞碎片；再经29500×g离提取血清exosome，比较不同提取方法所得样本差心20min，进一步去除细胞碎片和杂质；随后所得异，找到最适提取血清ex

7、osome方法，为后续研究上清液经过0．22μm一次性滤器，收集上清；最后提供实验证据。以120000×g离心90min，弃上清，沉淀以100μLPBS重悬，分装，于－80℃保存。此法收集的［2］doi：10．3969／j．issn．1006-5725．2015．15．015exosome标本代号为“A”。基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）器官移植关键1．3．2ExoQuickPrecipitation提取法（B法）血技术第三课题（编号：2012AA021003）；天津医科大学科学基金（编

8、清以3000×g离心15min，取上清；按照试剂说明号：2013KYQ19）书，加入450μL沉淀剂（4∶1），混合均匀后，4℃条件作者单位：200302天津医科大学医学检验学院（王仁峰，鲍下放置30min；将孵育好的样品以1500×g离心5会静，李雪，周迪苏，宋士伟，刘运德）；300072天津大学材料科学与工程学院（耿振，李朝阳）min，弃上清，沉淀以100μLPBS重悬，分装，于－80通信作者：刘运德E-mail：yundeliu＠126．com℃保