实验十八弓形虫病、住肉孢子虫病和结肠小袋纤毛虫病病原检查

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1、实验十九弓形虫病血清学诊断技术一、实验目的及要求掌握弓形虫病血淸学诊断技术，通逑扌弓形虫的检测和鉴定，为防治和预防弓形虫病提供科学依据。二、实验器材弓形虫虫株、小口鼠、恒温箱、离心机、血清、&砂蕊漏斗、纤维素滤膜、试管、载玻片、盖玻片、显微镜、荧光显微镜、冰冻切片机、吸管、湿盒、微量血凝试验型V反应板、微量加样器、无菌试管、一次性灭菌注射器、冰箱、胶乳试验玻璃板、常规石蜡切片机、染色缸、水浴锅、微量加样仪、ELISA板、等。跖品：牛理盐水、胰酶、美蓝染液、PBS、弓形虫诊断制剂(IHA抗原)、碘酒、70%酒精、无菌牛理盐水、5%柠檬酸钠、DAB、Tris盐酸、牛血清白蛋白(BSA)等。三

2、、实验方法步骤和操作要领。弓形虫病血淸学诊断技术主要有以下几种方法:(—)染色试验(Sabin—Feldmandyetese,DT)染色试验(Sabin一Feldmandyetese,DT)。是弓形虫特有的血淸学诊断法，此法特异性高而且被认为是标准的诊断方法。其原理是活的弓形虫速殖子与正常血清混合，在37°C作用lh或室温数小时灰,人部分滋养体市原来的新月形变为圆形或椭圆形，细胞质对碱性美蓝具冇较强的亲和力而被深染。但当弓形虫与含特异性抗体和补体(辅助因子accessoryfactor.AF)的血清混合时，虫体受到抗体和补体的协同作用血变性，对碱性美蓝不着色。计算着色与不着色虫体比例即可

3、判断结果。1.辅助因子。存在于止常人新鲜血清内，不耐热。用作辅助因子的血清需预先筛选，即将候选血清与弓形虫速殖子混合，37°C作用lh后，有90%以上虫体经美蓝染色后，着色者即含有辅助因子(AF)。含辅助因子血清可分装厉于一20°C保存备用。2.抗原制备。弓形虫速殖子经腹腔感染小鼠，3d后抽取腹腔液，生理盐水洗涤3次(3000r/minXlOmin),收集纯净虫体。也可将小鼠腹腔悬液用胰酶消化，经G?砂蕊漏斗或纤维素滤膜过滤纯化，所获虫体用辅助因子血淸稀释至每高倍视野50个左右虫体，即为抗原液。3.美蓝染液。美蓝10g加入95%乙醇溶液100ml,滤纸过滤,取3n)l加pHll的碱性缓冲

4、液(0.53%Na2C039.73ml,1・91%Na2B4070.27ml)10ml0碱性缓冲液临用前配制。4•待检血清。新鲜血清需经56°C30min灭活，或直接用牛理盐水倍比稀释后，每管0.lml,4°C中次日使用。5.检测。衣稀释血清内每管加上述抗原悬液0.1ml,37°C孵育lh,滴加美蓝染液0.02ml/管，继续温育15min后，口毎管取悬液1滴涂片，加盖玻片镜检。6.结果判定。计算各管不着色虫体的TT分比，以50%虫体不着色管的血清稀释度为该份被检血清的兹高抗体滴度。一般认为，抗体滴度1:8为隐性感染;1:956为活动性感染;1:1024以上为急性感染。DT所测抗体是虫体表

5、膜抗原诱导的特显性抗体。本试验易与肉抱子虫抗血淸发牛交叉反应；操作中需川活山；辅助因子血清筛选较烦琐。(-)荧光抗体试验(FA)荧光抗体试验(FA)该技术将血淸学的特异性和敏感性与显微技术的精确性结合起来，解决了牛物学上的许多难题。其原理是：用荧光素对抗原或抗体进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。1.直接荧光抗体试验。(1)标本制备。①切片制备。取被检动物腹般沟淋巴结压印片，冷丙酮4°C固定lOmino②洗涤。将固定好的压印片用O.Olmol/LpH值7.2〜7.4PBS漂洗,漂洗5次,每次3min,吹干。(2)直接染色。①在压印片上滴加川0.Ol

6、mol/LpH值&OPBS稀释的1：16的荧光标记的特异抗体。②放于湿盒内，37°C经30min孵育。③用0.Olmol/LpH值7.2〜7.4PBS漂洗，漂洗5次,每次3min,吹干。④用0.01%伊文思兰液复染，在滴加后立即洗去，并吹干。⑤载玻片上加缓冲甘油并覆以盖玻片封片。⑥置荧光显微镜下立即观察。⑦结果判定标准：++++黄绿色闪光荧光+++黄绿色亮荧光++黄绿色荧光较弱+仅有暗淡的荧光-无荧光2.间接荧光抗体试验。(1)标木制备。①切片制备。将冰冻的被检动物腹股沟淋巴结进行切片，冰冻切片置载玻片上，以一30°C丙酮4°C固定30mino②洗涤。将固定好的切片以PBS漂洗，漂洗5次

7、，每次3mino(2)间接染色。①一抗作丿在晾干的标木片上滴加弓形虫抗体，置湿盒，37°C作川30mino②洗涤。以吸管吸取P13S冲洗标木片上的弓形虫抗体，后置人fflPBS屮漂洗，共漂洗5次，每次3mirio③二抗染色。滴加荧光抗体，置湿盒，37°C染色30mino④洗涤。以吸管吸取PBS冲洗标木片上的荧光抗体，后置人量PBS屮漂洗，共漂洗5次，每次3mino⑤晾干。将标本片置晾片架上晾干。⑥镜检。将染色后的标本片置荧光显微镜下