基因打靶2011

《基因打靶2011》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、基因打靶（Genetargeting）郭长占北京大学医学部E-mail:guo4626@.yahoo.com.cn技术先进性实现转基因定点整合(一)基因打靶的原理基因打靶(genetargeting)是根据DNA同源重组的原理而设计的一项技术。在这一技术中，体内细胞基因组的某一段DNA序列被视为“靶子”，经精巧构建的欲导入的外源基因DNA序列被视为“弹头”，这样导入的外源基因进入受体细胞后就不再是随机整合而是“弹头”锚准“靶子”进行准确的定点整合。打靶载体(targetingvector)。如何使外源基因能定点整合于靶基因上呢?根据DNA同源重组

2、的原理，导入的外源基因必须和靶基因有一定的同源序列。因此，外源基因导入前必须经过精巧的构建，经构建的外源基因称为打靶载体(targetingvector)。78neo89678978neo896打靶载体野生ES细胞突变ES细胞基因打靶的结局有如下可能：(1)基因击入(geneknock-in)在受体细胞基因组中定点引入一个完全新的基因。(2)基因敲除(geneknock-out)受体细胞内源靶基因被灭活,。(3)基因替代(genereplacement)靶基因被导入的外源基因替代，可以是以正常基因替代突变的内源基因。(二)基因打靶的方法：进行基因

3、打靶要经历以下步骤：（1）构建打靶载体。（2）打靶载体导入受体细胞(常用胚胎干细胞(embryonicstemcell，即ES细胞)。（3）打靶ES细胞导入囊胚。（4）囊胚植入假孕母鼠子宫发育。1.打靶载体的构建：基因打靶的关键在于构建打靶载体。在打靶载体中需要一个与靶基因同源的DNA片段，这一片段称为同源重组指导序(homologousrecombinationdirectingsequences,HRDS)。外源基因插入这一同源序列之中。长度可从3kb至15kb。通过同源重组将外源基因导入固定位点,从而有目的的突变内源基因，图中单线表示内含子

4、，框图表示外显子78neo89678978neo896打靶载体野生ES细胞突变ES细胞2.外源基因导入靶细胞：基因打靶所使用的受体细胞一般用胚胎干细胞(ES细胞)，ES细胞是一种多潜能的干细胞，能在体外传代而不改变其多潜能性。小鼠胚胎干细胞是从着床前胚胎(孕3－5天)内细胞群分离的细胞。1981年由英国剑桥大学的Evans和Kaufman首先分离培养成功。英国卡迪夫大学(CardiffUniversity)卡迪夫生命科学学院MartinJ.Evans外源基因导入ES细胞的方法有:1.电穿孔法2.逆转录病毒载体法3.脂质体包装法4.磷酸钙沉淀法外源

5、基因导入ES细胞与否，还需经过G418和GANC培养基筛选。由于同源重组的频率很低，因而筛选并富集真正发生了同源重组的细胞是至关重要的。筛选可采用正负选择法。实现基因打靶的ES细胞能抵抗G418而不能利用GANC。G418GANC导入外源基因的阳性ES细胞的筛选正负选择法的原理在构建打靶载体时，打靶载体含有一段与靶基因同源的序列，将新霉素抗性基因(neor)插入到该同源序列的第一个外显子中作为正选择标（或者是靶基因最关键的外显子中）；neor可以抵抗G418.在同源序列之外的末端接上单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV－tk)基因序列作为负选择标志。

6、HSV-tK可以利用GANC而导致细胞死亡。123Hsv-tkneor同源重组（基因打靶GeneTargeting）如果导入的外源基因与靶基因发生同源重组，外源基因以及neor基因将整合于靶细胞基因组的同源序列位点上，而位于同源序列末端外的HSV-tk基因则在重组后丢失，此种情况下标志基因只有neor基因表达，则靶细胞同时具有G418和GANC双重抗性可在选择性培养基中存活下来。随机整合(RandomIntegration）如果导入的外游基因与细胞基因组随机整合，打靶载体将从头至尾全部整合入靶细胞基因组中，这种情况下，标志基因neor、HSV–t

7、k同时整合与表达。neor基因的产物使细胞具有G418抗性，而HSV－tk基因的产物使细胞能利用GANC(Gancyclovir,丙氧鸟苷）而死亡。这样存活下来的细胞必定是发生了同源重组的细胞。G418GANC在选择性培养基上存活的细胞必然是实现了基因打靶的细胞。正负选择性培养基打靶ES细胞的鉴定与扩增筛选出G418R/GANCR的细胞克隆后再用PCR方法进一步鉴定，鉴定后的ES细胞克隆在体外培养扩增。ES细胞注入囊胚与囊胚植入扩增后的ES细胞用显微注射的方法注入囊胚的胚泡中，再将囊胚植入假孕母鼠的子宫中发育。3.基因打靶小鼠的繁育(breedi

8、ng)用基因打靶的方法产生的第一代子鼠为嵌合体(chimera)小鼠，即小鼠由囊胚的细胞及经基因打靶的ES细胞共同发育而来。因此并非小鼠