转基因生物和基因打靶

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1、转基因生物和基因打靶Transgenicanimalandgenetargeting李信民1第一节转基因动物transgenicanimal概念:指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。特点：分子及细胞水平的操作，组织和整体水平的表达。目的：培育新种，获取人类所需的生物产品，或进行基因功能的研究。2基本原理将目的基因或DNA片段用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后再将其植入受体动物的输卵管或子宫中，使其发育成携带有外

2、源基因的转基因个体。3基本方法（一）显微注射法（microinjection）：用显微注射针将外源基因直接注射入实验动物受精卵的原核中，从而得到转基因动物。特点：导入速度快，操作简单，对DNA大小无限制。结果：发育成的小鼠中，10%-40%有外源基因。其中有80%成为典型的转基因动物。4基本方法（二）胚胎干细胞法（embryonicstemcell）：从着床前的动物胚胎中分离多功能胚胎干细胞→基因操作→注射入动物囊胚→形成嵌合体胚胎→嵌合个体。胚胎干细胞的作用：载体ES细胞可在体外培养，操作性好

3、。可用磷酸钙-DNA共沉淀法，逆转录病毒感染，电穿孔法转染，然后进行筛选和克隆。5基本方法（三）逆转录病毒感染法：将外源基因在体外构建成逆转录病毒重组体→转染包装细胞→假孕动物→发育个体特点：用于分裂后的早期胚胎，特别适于禽类的转基因研究。另有精子载体法。6转基因动物中外源DNA的检测染色体和基因水平：分离基因组DNA，进行斑点杂交，Southern杂交和PCR分析，原位杂交等以评估外源基因的整合情况。转录水平：Northern杂交，Rnase保护分析，PT-PCR。蛋白质水平：Western印

4、渍分析。7转基因动物的应用研究不同发育阶段基因组织和功能通过随机插入形成新的突变体，发现新基因建立外源基因表达、调控的动物模型动物新品种的培育基因产品的制备用于免疫机制和免疫相关疾病的研究及建立免疫性疾病的动物模型8第二节转基因植物transgenicplant概念:指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类植物。方法：获取目的基因→受体细胞培养→将目的基因导入受体细胞（载体直接转化或先转化农杆菌，后者再转化受体细胞）→培养转化细胞→筛选阳性细胞→培植阳性植株→转基因植株的鉴

5、定另外，也有用病毒介导的基因转移，电击法，基因枪法，显微注射，脂质体介导法，多聚物介导法，激光束穿孔法等9转基因植物在医学上的应用转基因植物实际上，可以被看作生物制备器，主要用于：生产药物蛋白制备口服疫苗生产单克隆抗体10第三节基因打靶genetargeting概念：指通过DNA定点重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究该基因的功能。包括基因敲除（geneknockout）和基因敲入（geneknockin）。11一基因打靶必备条件（一）1胚胎干细胞ES：小鼠受精卵发育第4-5天

6、的胚泡细胞。其特点为：可在体外培养，并保留发育的全能性将ES细胞进行体外遗传操作（geneknockoutorgeneknockin）后，重新植回小鼠胚胎，将会发育成小鼠的各种组织，最终形成嵌合体小鼠（chimericmouse)。若ES细胞能发育出小鼠的生殖细胞，通过交配即可得到基因敲除或基因敲入的小鼠12一基因打靶必备条件（二）2打靶载体：含有两种筛选标志，neoHSV-tk前者为阳性筛选标志，后者为阴性筛选标志neo阳性筛选标志：neo基因插入用于打靶的外源DNA中，当重组后，ES细胞能在

7、含G418的培养基中生长13一基因打靶必备条件（三）HSV-tk阴性筛选标志：HSV-tk是单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶基因。该基因产物可分解单核苷酸类似物而生成毒性产物，产生自杀效果。将HSV-tk基因插入外源基因外侧的载体序列中。当重组时，载体部分一般不发生整合作用。Tk-基因往往丢失。这样的打靶细胞，在含有含有单核苷酸类似物（如GCV）的培养基上能够生长。至于那些把整个基因打靶载体整合到核基因组上，而同时获得neo和HSV-tk两个基因的打靶细胞，由于GCV的特异致死性作用而无法存活。14基因敲

8、除的基本原理基因重组：其本质是基因的重排或交换。基因重组是经常发生的细胞内事件。基因重组分为同源重组（homologousrecombination），位点专一重组（sitespecificrecombination）和转位作用（transposition）三种。通过DNA同源重组，使ES细胞特定的内源基因破坏，经过胚胎发育，从而获得该基因丧失的小鼠模型。15同源重组的分子过程两段同源DNA彼此靠拢，在二条相同极性上断裂产生交叉结构在交叉处横断内切，产生4种含有异源双链的重组产物同源重组发生于2