小鼠基因打靶技术

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1、第六章小鼠基因打靶技术1989年，英国科学家马丁·埃文斯、美国科学家马里奥·卡佩奇和奥立佛·史密斯开创性的将基因打靶技术成功应用于小鼠，因为他们在基因打靶技术方面的贡献，获得了2007年度诺贝尔生理学或医学奖，评委会认为这一研究成果开创了全新的研究领域，为人类攻克某些疾病提供了药物试验的动物模型。 基因打靶是指利用细胞脱氧核糖核酸(DNA)可与外源性DNA同源序列发生同源重组的性质，定向改造基因组中某一基因的方法。它的产生和发展建立在胚胎干(ES)细胞技术和同源重组技术的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。上世纪80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体

2、外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除小鼠模型，这一技术可以瞄准某一特定基因，使其失去活性，进而研究该基因的功能。人类基因组计划的顺利实施使人类进入了功能基因组学研究的时代，与日俱增的大量遗传信息正对生物医学的研究方式和医疗模式产生巨大影响。发展和应用针对全基因组或全系统的高通量、大规模的整体实验手段，利用结构基因组学提供的信息和材料研究基因的功能将成为这个时代生物医学研究的主要特征。基因功能是在复杂生命体中实现的，功能基因组学

3、研究将在极大程度上依赖于对模式生物的研究。小鼠作为哺乳动物的模式生物具有独特的优势：首先小鼠是具有较短世代周期的哺乳动物,组织细胞的生理结构、功能特征和生化途径与人类相似，繁育能力强，易于在实验室条件下维持；其次，小鼠基因组规模(215×109bp)与人类基因组近似，许多染色体区域中同样的基因以同样的次序排列,拥有众多近交系，可在相对均一的遗传背景下分析，最重要的是，转基因技术和基因打靶技术的发展已使得对小鼠遗传物质按预期方式进行活体修饰成为可能。目前，全世界的科学家已经利用该技术先后对小鼠的上万个基因进行了精确研究，在ES细胞进行同源重组已经成为对小鼠染色

4、体组任意位点进行遗传修饰的常规技术。通过基因打靶获得的突变小鼠已经超过千种(相关数据库参见文献)，并正以每年数百种的速度增加。通过对这些突变小鼠的表型分析，许多与人类疾病相关的新基因的功能已得到阐明，并直接导致现代生物学研究各个领域中许多突破性的进展。这些变异小鼠对应的人类疾病包括心血管疾病、神经病变，糖尿病和癌症等。例如人类囊肿性纤维化病属于一种单基因遗传性疾病，马里奥·卡佩基等三位获奖者把这种致病的基因突变移植到小鼠身上，培育出了患囊肿性纤维化病的小鼠，为针对这一疾病治疗研究提供了动物模型，有望在药物或治疗方法上取得突破。显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆

5、转录病毒载体感染等基因转移技术能够有效地将外源基因导入靶细胞内，但这些导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的，可能导致下面几种结果：（1）外源基因整合位点在某一正常基因的中部，导致该基因表达的缺如；（2）外源基因导入位点在正常基因的侧翼序列，影响周围正常基因的活性；（3）由于外源基因整合位点不恰当，在细胞内不表达或表达难以控制；（4）外源基因的导入可能激活细胞内的原癌基因。为避免上述情况，最好的途径就是将外源基因导入预先确定的位点，即对细胞内靶位点进行定点修饰—基因打靶，研究该基因的功能或在生物发育中的作用。基因组计划的完成发现了大量未知功能的

6、基因，应用基因打靶技术对这些基因进行定向修饰是研究其功能最直接、最有效的手段。因此，基因打靶是继基因转移技术后亟待发展的新技术。一、基因打靶的基本原理基因打靶（genetargeting）：是指利用基因转移方法将外源基因引入细胞，通过外源基因与靶细胞染色体上同源序列间的重组，将外源基因定位整合到靶细胞染色体上某一特定位点，使基因发生定位突变的技术。对生物遗传信息的定位突变修饰包括基因缺失、基因置换、基因插入、点突变和染色体组大片段删除等。（1）同源序列的多少；（2）插入外源基因拷贝数和（3）。基因打靶的效率为转染细胞的10－3～10－7，这取决于外源DNA与

7、靶基因之间的同源序列长度，打靶载体是否线性化，插入位点染色质的松散程度，靶基因在基因组中的位置和靶基因的结构等。利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为：(1)构建基因打靶载体;(2)将基因打靶载体通过一定的方式(常用电穿孔法)导入同源的胚胎干细胞中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组,将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达;(3)筛选发生同源重组的阳性克隆，通过显微注射或者胚胎凝集的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内制作嵌合体小鼠，在生物活体中研究特定基因的功能。见下图：二、用于基因打靶的小鼠ES细胞ES细胞是一

8、类在体外培养条件下具有无限增殖和多向分化潜能的细胞。