基因打靶技术研究进展

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1、慕因打靶技术研究进展建立在胚胎干细胞(embryonicstemcell,ES细胞)与同源重组技术基础Z上的基因打靶技术(Genetargeting)是一•种定向改变牛•物活体遗传信息的实验手段［1-3］o通过对牛•物遗传信息的定向修饰，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而研究基因的功能，阐明生物体的遗传进化，疾病发生的分子机制，提供相关的疾病治疗药物、评价模型及新烈预防、治疗疫苗等，是后基因组时代基因功能研究的重要技术手段。本文概述基因打靶的背景、原理、策略、生物学应用及问题与展望。一、基因打靶研究的背景H前的基因转移技术，如显微注射、电穿孔、磷

2、酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等方法，已能有效地将外源基因导入靶细胞内。但这些导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的，可能导致卜面儿种情况出现：①导入的外源基因整合入某一正常基因的中部，导致该TT常基因表达的缺如；②导入的外源基因整合入细胞内正常基因的侧翼序列，影响了其周囤正常基因的活性；③外源基因的导入冇可能激活细胞内的原癌棊因；④导入的外源基因出于其整合位点的不适，而在细胞内不表达或表达难以控制。为避免上述情况的出现，最好的途径就是将外源基因导入预先确定的位点。即对细胞内靶位点进行定点修饰——基因打靶，而研究该基因的功能或在住物发育中的作用。随着人类及四

3、I•多种微牛•物基因组测序的完成，发现了人量未知功能的基因，应用基因打靶技术对这些新基因进行靶向修饰，是研究其功能最肖•接最有效的乎段。因此，基因打靶就H益成为继基因转移技术后亟待发展的新技术。二、基因打靶原理生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎T细胞技术的发展，促进了基因打靶的广泛应用。同源重组(Homologousrecombination)乂称一般性重组或非特异性重组(Generalrecombination),是指相似的DNA交换遗传信息的过程，外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换(即重组)。早在20世纪初,Morgan等人

4、通过对果蝇眼色遗传的分析揭示了同源染色体Z间的DNA重组是产生交换的棊础。1985年在哺乳动物细胞中实现了同源重组［4］。基因打靶通常是指用含己知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发牛同源重组，整合至受体细胞基因组屮并得以表达的一种外源DNA导入技术［5］。ES细胞是一类具有在体外培养条件下保持未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞类型的细胞。自从1981年美国的Gail［6］和英国的Evans等［7］分別成功地从发育中的小鼠囊胚的内细胞团(innercellmass)分离出胚胎干细胞，随后，又从原始生殖细胞种最终分化为精或卵细胞的早期胚胎细胞中得到具

5、有胚胎干细胞和似特性的细胞群，称为胚胎种系(embryonicgerm,EG)细胞［8］。胚胎干细胞注入体内与完報胚胎形成嵌合体后，可以发育形成包括生殖细胞在内的一系列成体纟11织［9］；正是由于胚胎T细胞的特殊功能，ES细胞基因打靶技术已被广泛地应用于建立转基因动物Z中。从80年代到90年代初，小鼠ES细胞基因打靶技术已发展到成熟阶段。1984年，Bradly等［10］成功地用显微注射法将ES细胞移入囊胚腔,并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，经过适当的交配，获得了源于ES细胞系的纯系小鼠。此实验首次证实体外培养的ES细胞能在体内分化发育成生殖系嵌合体并可获得小鼠纯合

6、体子代。1987年，人们利用ES细胞技术建立了次黄11票吟磷酸核糖转移酶(hprt)基因敲除(Geneknockout)的动物模型［11］。此后，这项技术得到了普遍应用和长足发展。三、打靶载体的构建基因打靶载体包扌舌载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基I大1等非同源序列，其屮同源序列是同源重组效率的关键因素。基因打靶载体有基因插入烈载体(Gene-insertionvector)和基因置换型载体(Gene—replacementvector)。插入型载体屮与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复，从而干扰了H标基因的功能

7、。置换型载体进行线性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧，线性化后，同源重组使染色体DNA序列为打靶载体序列替换。人多数基因敲除突变都采用置换型载体进行基因打靶。四、外源DNA导人的方式外源DNA导人的方式主要冇显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等。冃前应用最广的是显微注射法。Capecchi报道，用显微注射法导入可得到很高的转染效率，占接受外源DNA细胞的10%〜20%,但显微注射每次只能注射一个细胞，而电穿孔法可同时使许多细胞得到转染。Memsour等研究发现电穿孔可使1%的ES细胞稳定转染。逆转录病毒载体法利用某些病毒与