资源描述：
《条件性基因打靶技术研究进展》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、药 物 生 物 技 术54PharmaceuticalBiotechnology2001,8(1):54～57文章编号:100528915(2001)0120054204X条件性基因打靶技术研究进展1王 宏 沈子龙 奚 涛 成国祥(中国药科大学生物制药学院,南京210009;1上海市转基因研究中心,上海201300) 摘 要 以胚胎干细胞技术和同源重组技术为基础的基因打靶技术(genetargetingtechnology)在先后经历了以自身作为选择标记的同源重组,采用正负选择系统的同源重组,和
2、进行靶位精细操作的同源重组等3个阶段后,很快发展成为一种日臻成熟的基因操作技术,广泛应用于发育生物学、基因功能研究、医学病理模型的建立、基因治疗方法学的研究以及转基因动植物和生物反应器的制备等多个领域。尤其位点特异性重组酶体系如Cre2loxp体系在基因靶位操作技术中的应用,使得对基因修饰进行精确的时空调控成为可能。关键词 基因打靶;胚胎干细胞;Cre2loxp系统中图分类号:Q78 文献标识码:A[2] 基因打靶技术是指构建基因打靶载体,通过同源重组异性识别一段长34bp的特异序列,称为lo
3、xp位点。loxp原理在ES细胞中,经一系列的体外转染筛选和制作胚胎位点的不同方向可以决重组酶的作用方式:或者剪切掉两嵌合体途径,获得含特定修饰的基因型或者造成特定基因个同向loxp位点的片段,或者将两个反向v位点间的序列功能缺失的一种基因操作技术。通过基因打靶技术在小鼠倒置,如图1所示。Cre蛋白在哺乳动物细胞,尤其在ES[3]的整个基因组上进行特定基因修饰获得突变小鼠系。对基细胞中均具有活性,使其在基因打靶操作中具有着举足因功能进行精细的体内分析,给基因研究领域带来了突破轻重的作用。性的革命。
4、尤其近年来,基因打靶技术的不断改进以及一些外源位点特异性重组酶体系的应用大大提高了基因靶位技术的精确性。所谓条件性基因打靶(conditionalgenetar2geting)即在小鼠特定发育时期和/或在特定类型的细胞或组织中对基因的缺失进行调控。1 经典打靶方案中所存在的问题在经典的基因打靶方案中,将通过体外经筛选得到已完成突变的ES细胞导入母鼠囊胚,获得的嵌合体动物再经过近交纯合等手段,获得特定纯合基因型的小鼠。其不(a)Recombinationbetweendirectlyrepeated
5、loxpsites(filledtrian2足之处在于(1)对于功能重要的基因其突变常常会造成胚gles)leadstoexcisionoftheinterveninggenesegment,leavingone胎的过早死亡,对于该基因在生长发育过程中的研究不利;loxpsiteonreactionproduct.Notethatexcision(largearrow)ismuch(2)对于具有组织或器官特异性表达的基因,在小鼠所有器moreefficientthanreinsertion(sma
6、llarrow).官组织中该基因的缺失常常会给其特定组织中的功能研究(b)Recombinationbetweenloxpsitesofoppositeorientationleadsto[1]inversionoftheinterveninggenesegment.带来不确定的影响。Fig1Cre2mediatedrecombinationreactions2Cre2loxp体系3 条件性基因打靶Cre2loxp体系在基因打靶技术中的应用可以说给基因将基因修饰控制在某一特定时期或特定组织中,一直
7、靶位技术带来了一场革命。Cre重组酶是来源于p1噬菌是基因功能研究人员期望能实现的目标。这不仅可以有效体的重组酶家族的分子量38kd的一种活性蛋白,它可以特X收稿日期 2000208220王宏,女,1977年1月出生,山东省东营市人。中国药科大学生物制药学院硕士研究生.E2mail:dawn876@sina.com王 宏等:条件性基因打靶技术研究进展55的解决重要功能基因所带来的胚胎致死性问题,还可以对微注射获得的,可以通过Western杂交或针对Cre蛋白的[4]多功能基因在不同组织以及在生长发
8、育的不同时期的功能单克隆抗体进行检测。或者通过knockin技术将Cre编进行更精确的分析。随着体系在基因靶位操作技术中的应码序列定位整合于特定的启动子之下,这也是通过在ES[5]用,人们尝试着使用了多种打靶方案,大体可分:组织特异细胞中进行同源重组获得的。表1列出的是近几年里已性基因敲除和可诱导型基因敲除两大类。经建立的特异组织表达Cre蛋白的转基因鼠系。表达Cre3.1 组织特异性敲除蛋白的组织,半乳糖苷酶基因终止密码被破坏,因此通过[6]进行组织特异性敲除首先要获得由组织特异
