蛋白质纯化与鉴定实验指南 (1)

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1、目录序前言绪论1一、能用作纯化依据的蛋白质性质1二、分子相互作用的类型及其影响因素5三、分离方法的类型6参考文献7如何使用本指南9第1单元钙调蛋白的纯化DanielR.Marshak11实验1活性测定：钙调蛋白组分的活性测定19实验2组织提取物的制备24实验3粗分级分离32实验4离子交换层析39实验5疏水作用层析46实验6钙调蛋白的鉴定：收率的计算51实验7钙调蛋白的鉴定：电泳53、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳53二、无法垢剂的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳54三、尿素梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳与折叠分析56实验8蛋白质的裂解消化59一、钙调蛋白的溴化氰裂解63二、钙调蛋白的

2、胰蛋白酶消化64实验9反相高效液相色谱66实验10钙调蛋白的物理分析70一、紫外吸收光谱70二、蛋白质和肽的质谱71实验11钙调蛋白的化学分析75一、氨基酸分析75二、序列分析76试剂的配制82第2单元Hela细胞转录因子AP-1的纯化JamesT.Kadonaga89实验1Hela细胞核提取物的制备91实验2SephacryS-300HR凝胶过滤层析94一、如何装填凝胶过滤性96二、Hela细胞核提取物的SephacryS-300HR柱层析98实验3序列特异性DNA亲和层析101一、用制备凝胶电泳纯化寡核苷酸105二、DNA亲和介质的制备107三、亲和层析中非特异性竞争

3、DNA的正确使用112四、亲和层析的操作113实验4DNA酶I足迹分析117一、DNA酶I足迹探针的制备118二、DNA酶I足迹分析122实验5凝胶迁移变动分析126实验6肝素-SepharoseCL-2B的制备129试剂的配制131参考文献138第3单元大肠杆菌中过表达重组蛋白的纯化RichardR.Burgess和MarkW.Knuth141实验1大肠杆菌细胞的破碎和包涵体的配制144实验2包涵体沉淀的溶解、重折叠和离子交换层析148实验3可溶性提取物（核心RNA聚合酶-复合物）的聚乙烯亚胺沉淀和免疫亲和层152析一、PEI沉淀法分级分离可溶性提取物153二、免疫亲和

4、层析154实验4定量测定与制备小结158一、蛋白质的定量测定158二、定量SDS凝胶染色与扫描159三、定量蛋白质斑点印迹160四、酶测定法163五、纯化记录表164六、蛋白质纯化总结表与主要组分的总电泳照片165实验5蛋白质的鉴定167一、纯蛋白质的紫外光谱——A280mm/A260nm167二、消光系数的测定（Scopes法）167三、过载染色SDS凝胶扫描法估测纯度169四、由非变性凝胶电泳迁移率法评估均一性169方案补充实验：从过表达细菌提纯172一、快速蛋白质斑点印迹试验172二、是可溶的还是不溶的？173三、溶解包涵体沉淀需多少N-十二烷基肌氨酸钠？173四、

5、沉淀和RNA聚合酶需多少聚乙烯亚胺？174五、从PEI沉淀洗脱和RNA聚合酶需多少盐？175六、透析法除N-十二烷基肌氨酸钠需多少时间？176七、什么透析条件可使可溶的重折叠单体的得率最高？177八、蛋白质与免疫亲和介质结合需多长时间？178九、变性重折叠的其他方法179十、快速制定细菌过表达产物（无二硫键者）新纯化方案的策略182试剂的配制184参考文献189第4单元鼠肝胰岛素受体的溶解与纯化WilliamA.Brennan.Jr和Sue-HwaLin193实验1大鼠肝脏质膜的分离195一、分离肝脏质膜的Neville法197二、从组织分离粗制质膜组分的另一方法198三

6、、存在干扰物质条件下的蛋白质浓度测定199201四、膜上胰岛素受体数量的测定五、胰岛素受体对胰岛素亲和性的测定202实验2膜胰岛素受体的溶解205一、胰岛素受体的溶解及活性测定211二、溶解膜蛋白用的去垢剂的筛选213实验3溶解受体的凝集素亲和层析215实验4部分纯化受体的胰岛素亲和层析219一、胰岛素亲和层析220二、配体与活化介质的偶联221实验5胰岛素受体与胰岛素的交联223实验6胰岛素激素的胰岛素受体自磷酸化226实验7胰岛素受体糖基化的分析229试剂的配制234参考文献240附录243附录1pH的测量243附录2缓冲液的配制245附录3电导率的测量247附录4固

7、态硫酸铵法分级分离248附录5蛋白质的SDS-PAGE电泳249一、电泳251二、凝胶染色256三、样品制备（沉淀法）259附录6蛋白质的过甲酸氧化263附录7用亚氨基二乙酸Sepharose6B分离磷酸肽265附录8蛋白质内序分析用肽段的分离与纯化267附录9推荐读物269技术索引271主题索引273