第3代BiFC载体

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1、第三代BiFC（目的基因可以连接到YFPN/C上游或下游）l在YFPN和YFPC的5’和3’端都有多克隆位点MCS（1，2，3）,可根据需要把目的基因装在适合的位置。如果目的基因的结合域在靠近N端，可优先考虑接在YFP的5’端；如果目的基因的结合域在靠近C端，可优先考虑接在YFP的3’端。l使用两组不可逆重组LoxP突变位点（LoxP1L/1R、Lox2L/2R）把2个表达盒整合在一个质粒（LoxP1L只能与LoxP1R不可逆重组；LoxP2L只能与LoxP2R不可逆重组），可以大大提高2个表达盒的

2、共转化效率。l在NOS终止子末端EcoRI位点旁增加I-SceI位点。NE1L2L-nsI:MCSTCTAGAGTTAACCGGGCTCAGGCCTGGCGCGCCACTAGTGGATCCATCGATAGTMCS1XbaIHpaIStuIAscISpeIBamHIClaIACTGTCGACCTCGAGGGTACCGCTCCCGGGATGGAGCAAAAGTTGATTTCTGAGSalIXhoIKpnI/Acc65IXmaI/SmaIMCS2GAGGATCTTATG-YFPN-GCCGCGGATGCT

3、AGCGGCCGCAAGATCTGGCCGGCCTGGSacIINheINotIBglIIFseIApaIGCCCACCGGTAAAgeICE1RL2R-nsI:MCSMCS1TCTAGAGTTAACCGGGCTCAGGCCTGGCGCGCCACTAGTGGATCCATCGATAGTXbaIHpaIStuIAscISpeIBamHIClaIACTGTCGACCTCGAGGGTACCGCTCCCGGGATG-YFPC-AAGGCTAGCAAGATCTGGMCS3SalIXhoIKpnI/Acc65IX

4、maI/SmaINheIBglIICCGGCCTGGGCCCACCGGTAAFseIApaIAgeI3操作流程NE1L2L-nsICE1R2R-nsI将2种质粒等量混合，稀释成约10ng/ul，取1ul转化E.coliNS3529（表达Cre酶）,Amp（50ug/ml）/Kam（25ug/ml）双抗平板筛选，37℃培养>20h。或在平板培养～12h后（下午/晚上至第二天上午）混收少量菌接种到Amp（50ug/ml）/Kam（25ug/ml）-LB液体培养基成OD约0.5，再培养6－8h（到傍晚）。

5、从平板混收菌，提取质粒，稀释成～0.1ng/ul（过高浓度容易出现不同质粒的共转化，因此要避免高浓度质粒转化），取1ul转化E.coliDH10B(或NS3529以外的其它菌株)，Amp/Kam双抗筛选。取单菌落培养，提取和纯化质粒在(洋葱)细胞瞬间表达用EcoRI或I-SceI切出整个表达盒，连接到pCAMBIA1300或pCAMBIA1300(I-SceI)农杆菌转化植物，恒定表达3{注：I-SceI位点是17-base非回文序列，切割产生的粘性末端也是非回文；在pCAMBIA1300的MCS中

6、加入了2个方向相反的I-SceI位点，酶切后载体的2个末端不能自连，因此不需要脱磷反应}NE-1L2Lns:加I-SceI位点TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGC

7、GGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCEcoRIAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCATTACCCTGTTATCCCTACCGATCTAGTAACATAG

8、ATGACACCGCGCGCGATAATTTATCCTAGTTTGCGCGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACATGTTAATTATTACATGCTTAACGTAATTCAACAGAAATTATATGATAATCATCGCAAGACCGGCAACAGGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGCCAAATGTTTGAACGA