第3章 基因工程的载体

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1、第三章基因工程的载体前言载体通论第一节质粒载体第二节λ噬菌体载体第三节单链丝状噬菌体载体本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！前言载体通论一、基本概念利用重组DNA技术分离目的基因，称之为基因克隆(genecloning)。克隆(clone)：作物动词时是指从单一祖先产生同一的DNA分子群体或细胞群体的过程，作名词时指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊群体。基因文库(genelibrary)：由大量的含有基因组DNA的不同DNA片段的克隆所构成的群体。载体(vector)：在基因工程中，携带着目的基因或DNA

2、片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具DNA分子。二、分类克隆载体表达载体质粒载体噬菌体载体人工染色体按载体功能分按载体性质分表达体系载体宿主原核生物表达体系质粒、噬菌体细菌酵母表达体系大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒酵母转基因植物体系大肠杆菌-农杆菌穿梭载体（Ti质粒）、病毒等植株哺乳细胞表达体系大肠杆菌-农杆菌穿梭载体（病毒）、脂质体等培养动物细胞基因直接导入DNA本身（基因枪微粒轰击法等）生殖细胞、体细胞、个体三、基因工程载体必须具备的条件：※（1）有复制起点※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点※（3）具备合适的筛选标记※（4）具备合适的拷贝数目（5）分子量要相对较小

3、（6）在细胞内稳定性要高（7）易分离纯化※表示载体必须具备的条件第一节质粒载体一、质粒(plasmid)的基本特性Plasmid独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。质粒DNA多呈超螺旋的共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircular,cccDNA)，大小为1-200kb，可以持续稳定地处于游离状态，但一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随染色体复制而复制。编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达

4、，因此应用广泛。1、质粒的复制：由复制子(ori，复制起始区及与此相关的顺式作用元件)决定。质粒复制的机理请见教材。2、质粒的拷贝数：根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。作为载体的质粒一般应该是松弛型的。拷贝数是由复制起始点的类型决定的，如pMB1或ColE1。pUC系列载体中的突变型pMB1复制子可达500-700个拷贝。3、质粒的不亲和性(incompatibility)：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。涉及细胞分裂过程中的竞争

5、性选择。不相容群。4、质粒的转移性：自然条件下质粒可通过细菌的接合(conjugation)的作用而转移到新的宿主细胞中。三亲杂交法。质粒载体应具备的条件：1有特定的复制起始子。2有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个；3有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；4有一定容量；5有相当的拷贝数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。2021/6/19西南大学生物技术专业基因工程9二、标记基因1、选择标记基因：用于鉴别目的DNA的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。Ampr（氨苄青霉素抗性基因）：水解β-内酰胺环。Tetr（四环素抗性基因）：阻止四环素进入细胞。Cmr（氯霉

6、素抗性基因）：编码氯霉素乙酰转移酶。Kanr（卡那霉素抗性基因）：编码氨基糖苷磷酸转移酶。supF（琥珀突变抑制基因）：编码细菌抑制性tRNA，可翻译UAG为酪氨酸。赭石突变（UAA），乳白突变（UGA）。正向选择标记：蔗糖致死基因sacB。2021/6/19西南大学生物技术专业基因工程102、筛选标记基因：用于将重组子与非重子区别开来。α-互补(αcomplementation)：人工突变使大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)缺失N-端的第11-41位氨基酸，而载体则携带有LacZ基因的N-端140个氨基酸和编码区段(lacZ’)，二者单独存在时均无功能，但共存于一

7、个大肠杆菌细胞时则发生功能互补，形成具有完全活性的LacZ酶。多克隆位点(multiplecloningsite)：载体上的一段人工设计和人工合成的DNA序列，含有多个在该载体唯一的限制性内切酶的切点，以方便载体与外源片段的重组。插入失活(insretionalinactivation)：当一段足够长的外源DNA片段插入到一个功能基因的编码区后，导致ORF移码或提前终止，严重破坏原基因的编码能力而使该基因失活。蓝白斑筛选(white-bluescreening)：空载体转化子经IPTG诱导表达后，由于α-互补而形成的功能性的L