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1、妥布霉素高产菌株选育技术研究【中图分类号】TQ46【文献标识码】A【文章编号】an1672-3873(2011)03-0326-01【摘要】自然分离与诱变相结合，是黑暗链霉菌选育的有效途径。岀发菌株经UV诱变和耐受驯育，发酵效价显著提高。溶氧是妥布霉素发酵生产中的重要调控因子。【关键词】妥布霉素选育妥布霉素与其它抗生素联合使用，不仅可增强抗菌活性,还可扩大抗菌范围。此外，妥布霉素对第八对脑神经的耳毒性比新霉素、庆大霉素低。由于发酵效价不稳定，分离纯化困难，生产成本居高不下，销售价格昂贵，影响其普及使用。发酵效价采用
2、生物检定法组分检测用薄板层析和HPLC法。菌丝浓度测定，取发酵液10ml,3000r/min离心10min,去上清液后的固体物作为相对菌丝浓度。其它项目(总糖、还原糖、氨基氮等)均采用工业化常规分析法。二、结果与讨论出发菌株黑暗链霉菌TsO228主产尼拉霉素2,4和5三个组分，菌落较大，鞄子乳白，生测效价为3260u/mlo该菌株的单鞄子悬液经自然分离获得白色和淡黄色两类菌落,琼脂块法检测菌落的抑菌效果。结果显示白色菌落抑菌活性高于淡黄色菌落，具备较好的生产潜力。2、紫外诱变处理BTnO17菌株，制作单抱子悬液，分
3、别在30W紫外灯下照射10、30、50、70和90s,然后分离单菌落,进行琼脂块初筛，摇瓶发酵复筛,经紫外照射效价均有所提高。随着照射剂量的增加，死亡率渐次升高，正变率降低，负变率升高。其中50s为最宜剂量，致死率为85.1%，正变率为3.74%，负变率为15.1%,最高增幅为12.1%，此高产菌株编号为TvD204o3、耐自身代谢产物的分离筛选依据高效价具有高抗性，高抗性不等于高效价的原则,利用抗自身代谢产物对抗生素产生菌进行选育是提高抗生素产量的有效手段。在培养基上加入不同剂量的妥布霉素,发现随着剂量的增大，菌
4、株因进行适应调整，生长速度减慢,死亡率增大。4、菌株TtO49生长特性考察(1)斜面优质抱子培养时间的确定优质抱子的界定，用肉眼观察或显微镜观察都难以作出判断。界定优质抱子还是以斜面培养时间结合摇瓶发酵效价的方法，考察它们的相关性。(2)传代对生产力稳定性的影响菌株传代是否稳定是决定能否进入工业化生产的关键，为了考察所筛选菌株的传代稳定性，对TtD49菌株连续传代，第1代斜面FI,第2代斜面F2,第3代斜面F3,第10代斜面F10,分别进行摇瓶发酵。经测定,TtO49菌株各子代发酵效价均落在4800〜5300u/m
5、l,波动较小，可以认为是稳定的。(3)冷藏对稳定性的影响为了考察冷藏对斜面电子稳定性的影响，将置于49冰箱保存不同时间的斜面鞄子培养时间对效价的影响。5、种子特性考察(1)种龄的确定种龄控制不当，影响菌种生产能力的发挥。移种过早，潜伏期较长，甚至长不起来，即使生长了也容易衰老；移种太晚，种子走向衰老，不利于发酵和合成抗生素。为此，考察了种子培养时间对发酵效价的影响，借此来确定合理的菌龄。移种时间控制在16〜20h,对效价无太大影响，总效价均在4800u/ml以上。18h(pH6.74,菌浓10%)移种，发酵效价最高
6、，此时种子液颜色转黄，出现挂壁现象，镜检菌丝粗壮，分支多，染色深。当接种时间延长到24h时，种子菌丝开始变细、变长，空胞逐渐增多，发酵效价反而有所降低。数据还可以看出，种子的菌丝浓度高不等于种子质量好,22h的种子浓度达12%,但最终发酵效价不高，因此，冷藏时间对生产力的影响把握好合适的菌龄是把握好发酵的关键(2)接种量的确定接种量的多少，决定了产生菌在发酵开始的生长繁殖速度和潜伏期的长短，同时也影响其最终产抗生素的水平，因此，确定菌龄之后，对接种量进行考察。将培养18h的种子按不同接种量(1%,3%,5%,8%,
7、10%,15%)接入发酵瓶(40ml/250ml),37°C,250r/min摇床培养110h，考察接种量对发酵效价的影响，结果显示接种量10%时发酵效价最高。(1)溶氧对发酵效价的影响溶解氧对妥布霉素发酵至关重要[10,11]o体在自身生长、繁殖及合成次级代谢产物的过程中都需要一定量的氧气。溶氧过低，影响菌体的生长和产物的合成，特别是影响糖的代谢；但过大的溶氧量导致菌丝疯长，对生产不利。妥布霉素发酵中黑暗链霉菌的生长是为了达到一定的菌密度，以便在分泌期有更多的菌体起作用，如果某些养分过于充足，造成菌丝疯长，在显微
8、镜里观察到又粗又长的菌丝体，发酵液变得很稠，但妥布霉素的效价却很低。发酵罐上可以通过调节搅拌转速或搅拌叶和空气流量来控制溶氧，摇瓶上则通过改变装料量和纱布层数来控制，以发酵效价为指标，确定溶氧条件。本实验通过在250ml发酵瓶中改变发酵培养基装量来模拟发酵过程中提供不同的溶氧浓度，考察不同溶氧浓度对妥布霉素发酵效价的影响。摇瓶装量对发酵效价有一定的影响，其中
