定量聚合酶链反应的研究进展与临床应用

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1、定量聚合酶链反应的研究进展与临床应用屮华I矢学检验朵志2000年第2期第23卷综述作者：张华许叔祥单位：张华(200020上海市南洋医学放射免疫检测中心)；许叔祥(200020上海市南洋医学放射免疫检测中心)随着热稳定DNA多聚酶的发现，聚合酶链反应(PCR)技术发生了革命性的飞跃，使得其应用于临床成为可能，为医学检验及其研究提供了新的手段。已用于临床的PCR方法至今人都为定性分析，既无标准对照，也无质控，其最终产物用电泳法鉴定容易产生非特异性条带，结果重复性差，对靠性低，因而给临床诊断带来混乱。市于定性没有量化指标，所以无法

2、用于疾病随访和疗效观察。如何提高灵敏度和稳定性，并能对样品中的DNA和RNA进行定量分析是迫切需要解决的课题。一、目前临床采用的几种PCR定量测定方法1•固体捕获技术的运用。(l)PCR-酶联化学发光法：Marrin等［1］川固相捕获技术和酶联化学发光方法进行PCR定量。所有的反应均在微孔板上进行。由于引物上标有生物素，因而PCR产物上也标有相对量的生物素，它能定量地被链霉亲和素包被的微孔板捕获，然后用一荧光索标记的寡核井酸探针杂交，加入碱性磷酸酶标记的抗荧光素抗体，再加入化学发光底物，用发光仪检测其光信号，与标准曲线对照定量

3、DNA或RNA。(2)荧光标记引物法：Londgraf等［2］将一对引物分别标记生物索和荧光索，扩增灰得到5’端分别标有生物素和荧光索的双链扩增产物，其中标有生物素的一端被包被有链霧亲和索的微孔板吸附，另一端的荧光素被激发后发光，根据荧光强度定量DNAo(3)PCR-tW-联免疫吸附法(ELISA)：地高辛或牛物素或荧光素标记引物，扩增后的DNA产物即标有地高辛或牛物素或荧光素。该产物被固相板上特异的探针(用生物索链密亲和素交联在板上)所结合，再加入抗地高辛或生物素或荧光素酶标抗体■辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色［3］

4、。以上3种方法均是对固相免疫定量分析技术的灵活运用，尤其第3种方法只需热循坏仪和酶标仪，因而应川最广，如何将这一过程自动化是一个发展方向。2.荧光双标记探针法：其原理是利用Taq酶的5’端外切酶活性。扩增时在加入特异引物的同时加入一荧光探针，该探针为一寡核甘酸，标记有一个荧光基团和一个熄灭基团，扩增时，每形成一条DNA链即有一双标记探针被偶联，Teq酶切去其荧光基团，其与熄灭棊团分离。即每扩增一条DNA链，溶液屮就增加一个荧光分子，即时或扩增后监测荧光强度,即时与标准曲线相比定量(Q)PCR［4］。现己有将此方法研究成的专利产

5、殆，并发展了专用仪器ABI-7700仪器。3.内参照法：在不同的PCR反应管中加入已知量的内标和引物，内标用基因工程方法合成，上游引物用5’•荧光标记，下游引物未标记，在模板扩增的同时，内标同时被扩增,在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物很容易用电泳或高效液相(HPLC)分离开來，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量mRNA［5］。4.竞争法：选择由突变克隆产牛的含有一个新内切位点的外源性竞争性模板。在同一试管中，待测样品与竞争模板用同一对引物(其中一-个引物为荧光标记)同时扩增。扩增后用内切酶消化PCR

6、产物，竞争性模板的产物将在内切位点处裂解为两个片断，而待测样木的产物不变，从而被区分(电泳，HPLC等)，通过荧光强度测定可与竞争物比较。两模板长度类似，扩增效率相近，由于竞争模板为已知量，可推测待测RNA含量［6］。二、定量PCR的临床应用1.在传染性疾病方而的应用。(1)人类免疫缺陷病毒(HIV)：Atkins等［7］用QRT-PCR研究HIV感染者对叠氮胸昔(ZDV)的抗性是由于其反转录酶的41、67、70、215处发生了点突变，有助于解释对ADT的耐药性，可川于HIV治疗方案的设计；Tetali等［8］通过测定HIV-

7、RNA的浓度，发现血浆中病毒量与疾病进展和存活率的关系，并可早期检出无症状携带者。⑵丙型肝炎病毒(HCV)：Ro山等［9］川定暈逆转录(QRT)-PCR检测血清屮HCV-RNA含量和HCV基因分型，认为是预测和监视a■干扰素治疗的重要指标。Casanovas等［10］用QRT-PCR检测出血淸中HCV-RNA含量高的母亲传染危险率大于平均垂ft感染率(12%)。⑶乙型肝炎病毒(HBV)在乙肝的治疗过程中，慢性肝炎治疗终点的血清学标志叩为HBV-DNA的消失。研究发现，可以HBV-DNAjflL清浓度的变化来评价药物疗效与病毒载

8、量的关系［11］。一般定性PCRC不能满足临床的需要，必须进行定量PCR测定。1.定量mRNA。传统方法的灵敏度均达不到检测低表达mRNA的要求，因一些编码受体和内部信息分子的mRNA,巾于其拷贝数极低只能用QRT-PCR方法，通过在不同反应管中加入内标,控制RT-PCR的扩