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1、三磷酸腺昔二钠片微生物限度检查法验证探究摘要：建立三磷酸腺昔二钠片的微生物限度检验方法。采用常规法对样品进行方法验证。结果五种规定试验菌的回收率均不低于70%,可用于三磷酸腺昔二钠片的微生物限度检验。关键词：三磷酸腺昔二钠片；微生物限度检查；方法验证三磷酸腺昔二钠片是细胞代谢改善药。根据其制剂用药途径，应进行细菌数、霉菌和酵母菌数的测定、及控制菌一大肠埃希菌检查。经实验研究，确定采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌检查。经对所确定的方法进行验证，符合2010年版《中国药典》二部附录XIJ有关微生物限度检查法有关规定，方法可行。1实验仪器、试
2、药1.1实验菌种枯草芽胞杆菌CMCC(B)63501、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、大肠埃希菌CMCC(B)44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003。1.2样品：三磷酸腺昔二钠片：批号：20101101,20101102,20101103o1.3培养基及稀释剂营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，营养肉汤培养基，胆盐乳糖培养基（BL）,改良马丁培养基，MUG培养基，曙红亚甲蓝琼脂培养基，pH7.0无菌氯化钠一蛋白淼缓冲液，0.9%无菌氯化钠溶液等。1.4仪器培养箱、高压蒸汽灭菌器等。2细菌数、霉菌和酵母菌数
3、测定方法的建立及验证1.1菌液制备取经351培养18〜24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌的营养肉汤培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50〜lOOcfu的菌悬液，备用；取经25°C培养24〜48h的白色念珠菌液体培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50〜lOOcfu的菌悬液，备用；取经25°C培养1周的黑曲霉斜面培养物，加10ml0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌砲子，吸取菌液用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每lml含菌数为50〜lOOcfu的菌悬液，备用。2.2供试液的制备方法常规法：取样品10g,用pH7.0
4、无菌氯化钠一蛋白淼缓冲液制成1：10的供试液；取1：10的供试液lml注皿。2.3回收率试验试验组：同2.2,另分别取各试验菌50〜100CFU,分别注入同一平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24〜48h,白色念珠菌和黑曲霉培养48〜72h。菌液组：取试验菌50〜100CFU注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24〜48h,白色念珠菌和黑曲霉培养48〜72h,测定所加入的试验菌数,平行制备2个平皿。供试品对照组：同2.2,立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24〜48h,霉菌和酵母菌培养4
5、8〜72h,测定供试品本底菌数。2.4方法的确定选用金黄色葡萄球菌、白色念珠菌作为敏感菌株进行预试验，结果：金黄色葡萄球菌回收率为97%,白色念珠菌回收率为93%,表明三磷酸腺昔二钠片对细菌、真菌没有抑制作用，采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数测定可行。稀释剂无抑菌作用，对实验无干扰。2.5细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证三批号样品的验证试验结果表明，以常规法进行三磷酸腺昔二钠片细菌数、霉菌及酵母菌数测定，五种规定试验菌的回收率均大于70%,符合《中国药典》的规定，方法可行。确定三磷酸腺昔二钠片细菌数、霉菌及酵母菌数计数方法为常规法。3控制菌检验方法的
6、建立及验证菌液制备同2.k1.1大肠埃希菌检查方法常规法：取1：10供试液10ml接种至100ml胆盐乳糖培养基，同时加入大肠埃希菌10〜100CFU,35"培养24〜48ho取培养物0.2ml接种至含5mlMUG培养基的试管中，35°C培养24h左右，366nm紫外灯下观察荧光，然后进行靛基质试验，观察结果；另取培养物划线接种于曙红亚甲蓝(EMB)平板，35°C培养18〜24h,观察其菌落形态。3.2大肠埃希菌试验结果经胆盐乳糖(BL)培养基培养后，试验组与阴性对照组相比较有明显的变化，试验组有明显产酸产气现象，结果见表2。4结语根据上述实验结果，拟
7、定三磷酸腺昔二钠片微生物限度检查法标准正文如下：微生物限度照微生物限度检查法(《中国药典》2010年版二部附录XU)o取本品10g,用pH7.0无菌氯化钠-蛋白豚缓冲液制成1：10的供试液。细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌取1：10的供试液，采用常规法，依法检查，应符合规定。细菌数每lg不得过lOOOcfu,霉菌和酵母菌数每lg不得过lOOcfu,大肠埃希菌每lg不得检出。5三批三磷酸腺昔二钠片的微生物限度检查参考文献：2010年版《中国药典》二部
