银耳芽孢内源gpd启动子克隆及功能鉴定

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1、银耳芽胞内源gpd启动子克隆及功能鉴定利用反向长距离PCR技术从银耳(Tremellafuciformis)芽鞄gpd基因出发克隆上游gpd启动子序列，将预测的gpd启动子片段与多功能纤维素基因(mfc)连接构建表达载体,与潮霉素抗性质粒pBgGl-hph共转化银耳芽胞，对拟共转化子进行酶活发酵试验。结果表明：4轮反向长距离PCR克隆得到了1761bp的上游序列，经预测启动子落在上游1000bp左右区域内，包含两个高分值的起始转录位点，将gpd启动子分成gpdTrel(885bp)、gpdTre2(708bp)、gpdTre3(466bp)3段区域，分别与多功能纤维素基因(mfc)构建表达载体

2、pgTrel-mfc、pgTre2-mfc和pgTre3-mfc。拟共转化子酶活发酵试验结果发现3个表达载体的转化子均能检测到多功能纤维素酶活，转化子T1-2包含gpdTrel启动子大片段，整体酶活最高，CMC酶活为14.12U/mL,比出发菌株TrOl提高34.3%,比工程菌株yLes3提高25.7%,木聚糖酶活为34.8U/mL,比TrOl酶活提高26.3%,略低于yLes3o3个启动子片段均具有表达活性，相比之下885bp的大片段gpd启动子表达活性更高。银耳；芽砲；gpd启动子；反向长距离PCR；多功能纤维素酶银耳(Tremellafuciformis)俗称白木耳，是著名的食药用真菌，

3、隶属于真菌门(Eumycotd)、异隔担子菌亚纲(Heterobasidiomycetes)、银耳目(Tremellales)、银耳科(Tremellaceae)、银耳属(Tremella)o近年来，关于银耳栽培技术、加工及药用价值的研究取得了快速发展，然而,与其它真核生物相比，银耳表达系统的研究基础还相当薄弱，特别是关于启动子方面的研究。银耳担胞子芽殖产生酵母状分生胞子称为银耳芽胞。银耳芽胞单核，后代遗传稳定，能像酵母那样快速生长且容易培养，已有较完善的液体深层发酵培养技术［1］,具有完整的蛋白表达修饰系统，是一种优良的外源基因表达宿主。启动子是外源基因表达系统表达调控的重要顺式元件，是影响

4、转录起始效率的重要因素，很大程度上决定基因的转录速率及基因表达效果。在异源表达中，使用同源或近源的启动子有利于受体细胞调控因子的识别，减少甲基化，促进外源基因整合到染色体上，提高转化及表达效率［2-4］。目前在银耳基因工程中广泛应用的启动子均为异源启动子，如CaMV35S启动子，构巢曲霉(Aspergillusnidulans)gpdAn启动子、香菇(Lentinusedodes)gpdLe启动子、灵芝(Ganodermalucidum)gpdGl启动子［5-8］等，经常会出现无法启始转录或启始转录活性很低等现象，从而导致银耳转化效率低，外源基因表达水平低等难题。gpd(glyceraldeh

5、yde-3-phosphatedehydrogenase)基因是糖酵解途径的关键酶基因，其启动子具有很强的调控异源基因表达的活性，最早从酿酒酵母中分离并被证实［9］o目前食用菌遗传转化的最常用的启动子为ras启动子和gpd启动子，1999年，HIRAN0等［10］首次从香菇中分离得到gpd启动子，并证实了gpd启动子能有效地调控外源基因在香菇中的表达，且后代遗传稳定，比ras启动子具有更高的启动子功能活性。目前，已相继从裂褶菌(Schizophyllumcommune)、双胞蘑菇(Agaricusbisporus)、金针菇(Flammulinavelutipes)、云芝(Polystictus

6、versicolor).草菇(Volvariellavolvacea).灰树花(GrifIolafrondosa)等［11-15］食用菌中分离得到gpd启动子，且在各自的同源转化中表现出很强的功能活性。但是目前还没有从银耳芽胞中克隆分离得到完整的gpd启动子的报道。本研究采用反向长距离PCR(LD-IPCR)克隆银耳芽胞内源gpd启动子，该技术克服了传统IPCR中扩增片段小、假阳性多的不足［16］,与巢式PCR技术结合，具有良好的特异性及灵敏度［17］,是克隆启动子序列快速、简便、经济的方法。银耳芽砲内源gpd启动子的克隆不仅可以解决银耳外源表达的问题，还可为食用菌表达系统提供更多可选的有效强

7、启动子。1材料与方法1.1菌株银耳(T.fuciformis)菌株TrOl购自福建古田食用菌研究所；yLes3为香菇(L.edodes)gpdLes启动子驱动表达多功能纤维素酶的银耳芽胞工程菌株，由华南农业大学食品学院生物炼制实验室构建。1.2质粒质粒pgLes-mfc含多功能纤维素酶mfc基因［18］及香菇gpdLes启动子，质粒pBgGl-hph含潮霉素抗性hph基因及灵芝gpdGl启动子，均