海参寡糖的抗血栓活性研究

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1、美国肉参硫酸软骨素寡糖的制备及其抗凝血活性研究李琳孙翠萍(中国海洋大学食品科学与工程学院，青岛266003)摘要：木文采用酶解提取法、CPC沉淀提取海参粗多糖，经醇沉、冷冻干燥、离了交换层析、透析,得到纯度较高的海参多糖(AMP),通过HPLC测定其分了量为56.2KD；利用柱前衍生窩效液相色谱法测定AMP的单糖纽•成，绝人部分为氨基半乳糖(GalN).匍萄糖醛酸(GlcUA)、半乳糖(Gal)和岩藻糖(Fuc),含少量GlcN、Rha和Xyl,其中GalN、GlcUA和Fuc的含量相近。再以肝索为对照，通过测定凝血三项，研究海参

2、硫酸软骨索的抗血栓活性。结果农明，海参硫酸软骨索貝有较好的抗血栓活性。关键词：海参硫酸软骨素、氧化降解、抗凝血海参(Holothutia,seacucumber),棘皮动物门(Echinodermata)海参纲(holothuroidea)牛物⑴，具有较高的经济价值和药用价值，自古以来就被奉为营养佳品。而海参多糖是海参体壁重要的活性成分Z-,其含量可占干参总有机物的6%以上，具有抗凝血、抗肿瘤、免疫调节、延缓衰老等多种牛物活性⑵。海参多糖主要有海参硫酸软竹索(seacucumberchondroitinsulfate,SC-CHS

3、)川和海参岩凜聚糖硫酸酯(SC-FUC)⑷两种多糖，其中SC-CHS是从海参体壁中提取的-•种多糖，可來源于多种海参，虽其化学结构不尽相同，但生物学活性相似。先前YutakaKariya和PauloMourao等课题组均采用了稀酸法制备寡糖方法，容易导致硫酸基和支链硫酸岩藻糖的脱落,影响相关的活性。化学氧化法已被用来降解硫酸软骨素、硫酸皮肤素及肝素等糖胺聚糖，Tasneem等认为氧化降解的主要是使川嗦•屮的非硫酸化糖醛酸的C2和C3Z间的键发生断裂，并II能够得到适当的平均分子量和分子量分布的寡糖组分，而这种降解方式倾向于先降解易

4、氧化的部位，因此对支链结构的影响较小，适合于制备海参硫酸寡糖。硫酸岩藻糖分支结构与SC-CHS的多种生物学活性相关，其特异性的空间排列是SC-CHS抗凝活性的基础，SC-CHS延长激活的部分凝血活酶时间(APTT)的作用明显强于具有和同硫酸化程度的线性岩藻糖同源性多聚体。硫酸岩藻糖支链还与SC-GAG降血脂、促进脐静脉内皮细胞增殖和移位、促进血管再生作用相关。因此制备富含岩藻糖支链的低分子量海参硫酸软骨具有重要的意义。棊于以上学者的研究成果，本研究的内容是：拟以美国肉参为对象，采用现代生化分离技术提纯海参硫酸软骨素(SC-CHS)

5、,再对其采用稀酸法、卿法和氧化降解法等手段对其进行对控降解，并获得富含岩藻糖支链的混合SC-CHS寡糖，并通过牛化分离技术对其进行分离、纯化，通过抑制凝血因子和体外抗凝血两条途径研究SC-CHS寡糖的抗血栓活性。1材料与试剂1.1材料自青岛市场上购得美国肉参：ChelexlOO螯合树脂，Sigma公司；硫酸软骨素酶ABC,透明质酸臨(美国sigma公司)；低分子量肝素(医药学院于广利老师提供，分子量约为4000Da)o1.2试剂盐酸十六烷基毗I定，(CetylpyridiniumChloride,CPC,上海生工生物工程公口1)；

6、木瓜蛋口酶，盐酸起氨，半胱氨酸，肌醇，二甲基氨基苯甲醛(DMAB),Cu(AC)2H2O,双氧水，硫酸钾，HC1,H2SO4,HNO3,NaOH,NaCL(NH4)2CO.p95%乙醇，三氟乙酸(TFA),均为国产分析纯。标准品：L■鼠李糖(Rha),L・阿拉们糖(Ara),D■木糖(Xyl),D・甘露糖(Man),D・葡萄糖(Glc),D-半乳糖(Gal)(上海化学试剂公司)；L-岩藻糖(Fuc)(Fluka)；D-葡萄糖醛酸(GlcUA),D-(+)・半乳糖醛酸(GalUA),D-(+)■氨基葡萄糖(GlcNl),D-(+)■

7、氨基半乳糖(GalN),岩藻聚糖硫酸酯(Fucoidan),蓝色箭聚糖(Bluedextran,type2000,Mw2,00(),(X)0),L■岩藻糖(Fuc,Mw164.1),硫酸葡聚糖(Dextransulfatesodiumsalt,Mw5,000,Mw10,000),葡聚糖(DextranMw10,000,Mw41,100,Mw66,900,Mw148,000)(美国sigma公司)。1.3色谱柱及填料及主要仪器SepHacryl-S30(),AmershanBiosciences公司；TSK-gelG3000PWxl

8、,色谱柱，TosohBioscience公司；Bio-GelP2,Bio-Rad公司；SephadexG10,AmershanBiosciences公司；HW-40C,TosohBioscience公司。冷冻干燥机(ALPHA1-4LD),應ICH