青蒿琥酯治疗小鼠结肠炎的研究

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1、第一部分青蒿琥酯对oxazolone小鼠结肠炎的作用1动物和材料1.1动物：C57BL/6小鼠，雌性，清洁级，6-8周龄，体重约16-20g,由中国科学院上海实验动物中心提供，饲养于上海第二军医大学实验动物屮心。1.2主要试剂和仪器：1.2.1恶P坐酮(oxazolone)购自Sigma公司1.2.2青蒿琥酯购自广四桂林南药股份有限公司1.2.3Leica石蜡切片机1.2.4无水乙醇、水合氯醛购自上海国药集团1.2.5去离子水机，购自M1LLIPORE公司1.2.6超低温冰箱，购自日本SANYO公司1.2.7涡轮混和器，购自太仓科教仪器厂1.2.8电子天平，购自美国MettlerInc公司

2、1.2.9雪花状制冰机购自美国GRANT公司1.2.10磁力搅拌器，购自上海司乐仪器厂1.2.11超速低温离心机，购自德国Eppcndoff公司1.2.12石蜡切片机，购自德国Leica公司1.2.13病理染色机，购自德国Leica公司1.2.14免疫组化用载玻片，购自上海长岛生物科技公司1.3配置的主要试剂1.3.110%的水合氯醛1.3.250%的乙醇溶液：用无水乙醇与PBS以1：1体积混合1%oxazolone/乙醇溶液：lmgoxazolone溶解于50%乙醇溶液3%oxazolonc/乙醇溶液：3mgoxazolone溶解于100%乙醇溶液1.3.5青蒿琥酯注射液：用青蒿琥酯粉末

3、溶于碳酸氢钠溶液2实验方法2.1动物实验(1)动物分组：将体重相近的小鼠随机分为3组，具体如下表所示:表1：小鼠分组情况分组灌肠液腹腔注射药物7天模型组7天治疗组7天对照组oxazolone/50%乙醇溶液oxazolone/50%乙醇溶液50%乙醇溶液碳酸氢钠溶液，连续7天青蒿琥酯注射液，连续7天碳酸氢钠溶液，连续7(2)小鼠结肠炎模型的建立致敏1)小鼠于灌肠前7天腹部皮肤剃毛(1.5cmx1.5cm)。2)对照组皮肤涂搽0.15ml100%乙醇溶液致敏；模型组及治疗组皮肤均涂搽0.15ml3%的oxazolone溶液致敏。灌肠1)禁食：灌肠前12小吋禁食，自由饮水。2)麻醉:10%的水

4、合氯醛腹腔注射。麻醉后将小鼠I古I定于鼠板上。3)灌肠：注射器直接连灌肠管，抽取灌肠液100卩1,灌肠管从肛门进入肠内约4cm,缓慢注入灌肠液，保持小鼠倒立位2min。将小鼠放回笼中，给食并观察[36-38]o(3)治疗灌肠约8小时后，按分组给药：治疗组小鼠腹腔注射青蒿琥ffi(150mg/kg/天)，模型组和对照组小鼠腹腔注射碳酸氢钠溶液。（4）观察指标1）每FI观察小鼠体重变化，精神状态，有无腹泻，联苯胺法检测粪便有无隐血，以及各组小鼠的死亡率。2）粪便隐血检测：采用联苯胺法。具体过程如下：用竹签挑取少许粪便于滤纸上，加1%联苯胺冰醋酸溶液1・2滴，加3%H2O21-2滴。结果判断：加

5、试剂后2分钟不显色，为阴性；加试剂后显蓝褐色，为阳性。3）疾病活动指数（DAI）评分：评分标准见表2[39]：表2：DAI评分标准体重下降（％）人便性状0无止常阴性11-526-10糊状便隐血（+）311-154>15稀便肉眼血便DAI=体重下降+大便性状+便血2.2组织样本的获取及大体评分1取结肠组织：颈椎脱臼法处死小鼠，75%酒精消毒腹部皮肤。①沿腹中线逐层剪开皮肤、皮下组织、腹膜，钝性分离肠系膜及脂肪组织，大体观察肠道病理变化（评分见下段）。②将远端近肛门处肠管剪断，近端近肓肠处剪断，用PBS冲洗干净。在距肛门大约4cm处截取肠管，浸入10%福尔马林中固定24-48小吋。③用组织剪剪

6、开肠管,观察肠道有无糜烂，溃疡，并进行评分（评分见下段）。④选取炎症组织，锡纸包裹，放入液氮罐中保存。2结肠组织大体评分：评分标准[40]:0分：正常；1分：局部充血，无溃疡；2分：有一溃疡，但无明显充血或结肠壁增厚；3分：有一溃疡，炎症明显；4分：2处或2处以上的溃疡和炎症；5分：主要的结肠损伤区域延伸超过2cm。2.3结肠组织HE染色和病理学评分取出固定于10%屮性福尔马林液中的组织，经各浓度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成蜡块，切成4pm切片，HE染色，光镜下观察，进行病理学评分。评分标准为［41］：0分：无炎症；1分：结肠轻微炎症；2分：结肠屮有较少量炎症细胞如淋巴细胞、中性粒

7、细胞等浸润；3分：大量的炎症细胞如淋巴细胞、中性粒细胞等浸润，高血管密度，结肠壁增厚；4分：炎症细胞透壁浸润，杯状细胞缺失，高血管密度，结肠壁增厚。3结果3.1—般情况（1）造模当口，模型组小鼠精神倦怠，活动进食减少，开始腹泻黄色稀便或血便，体重下降，造模后第2天达到高峰；第3天开始情况好转，大便从稀便或血便变成软便或糊状便，第7天有些小鼠恢复到正常，但有些小鼠在第7天依然腹泻黄色稀便；体重从第3天开始冋升，到第7天仍没