微生物次生代谢产物研究方法-3

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1、第三讲色谱学原理与实际应用（2）－－非常压色谱减压柱中低压柱高压液相色谱气相色谱减/加压的目的：实现快速分离或为适应分辨率高但流速慢的小粒度固定相3.1减压柱层析（抽柱VacuumLiquidChromatography)1简介简便、实用、快速的层析方法，其基本原理与吸附层析相同，适用于较大量的制备性分离或提取物的极性分段划分。（粗分）2操作VLC柱（或布氏漏斗）、磨口收集瓶（或抽滤瓶）、真空泵。a装柱（抽实）b上样（一般干法，抽实）c洗脱（低极性逐渐到高极性的梯度洗脱，每次都抽干，类似pTLC多次展开的过程）d收集3注意事项a真空度20~70mmHgb洗脱剂极性由小到大梯度递增

2、c交叉色带3.2中低压柱层析1）快速色谱（闪式柱层析，FlashChromatography）1简介柱短（20cm），分离时间短，快，分离效率高。闪式硅胶（FlashSicicagel，230～400目，球形）加压层析约2bar10mg-10g样品10-15min2用途常用于快速分段/初步纯化，尤适于常压柱上长时间分离过程中易分解的化合物，拖尾少3操作与普通柱层析法基本相同。a装柱：湿法干法（20cm）b上样：拌样湿法c洗脱：Rf0.2-0.3加压1atm=10bar=106Pa=760mmHg2）低压柱适用样品：10mg～1g压力小于5bar固定相：硅胶、氧化铝、聚酰胺、反相硅

3、胶等各种分离材料，普通粒度，因此在低压下也有较快流速。吸附也不是特别严重。一般配有自动收集器、紫外监测器和低压恒流泵/氮气瓶，有的还可联机监控、操作和分析。有些商品化的预制色谱柱，如E.Merck公司产的Lobar柱系列产品（粒度150～250目），其分离效果有时可接近HPLC的分辨率，但载样量远超过制备型HPLC。也可自己装填。2）中压液相色谱系统（Medium-pressureLC）适用样品：100mg～100g压力5～40bar固定相：硅胶、氧化铝、聚酰胺、反相硅胶等各种分离材料，较细较均匀颗粒（硅胶常直接用薄层层析材料（粒度15um，约700目）），分辨率很高，但常压下基

4、本流不动，在中压下才有较快流速。有一定程度的吸附。均配有自动收集器、紫外监测器和压力输液泵，有的还可联机监控、操作和分析。如BUCHI公司生产的中压液相系统，还配有一系列规格的耐压玻璃－塑料加强色谱柱，其中有些为预制柱，如反相柱，有些可自己装填分离材料。还可选配其它类型的监测器如示差折光监测器。2操作a装柱（氮压）b上样（干法或湿法，样品柱）c洗脱（所有管材均耐压耐溶剂）d收集（较智能化自动收集，等时间或按峰收集）3.3高压液相色谱系统（HighPressureLC，HighPerformanceLC）化合物分析与制备分离的强大武器高压液相色谱法是在经典色谱和气相色谱法的基础上发

5、展起来的，在色谱理论方面没有本质的差别。但由于采用了高效固定相、高压输液泵、高灵敏度检测器等新技术，因而有了更高的分离效率并实现了自动化。六大系统：输液、进样、色谱柱、检测、记录与数据处理、（收集）生产商：Agilent、Waters、岛津、Dionex、国产自动/手动等度/梯度各种固定相多种选择100~500bar固定相：一般为化学键合固定相附：手性柱检测器专用型检测器通用型检测器紫外检测器（UVD）荧光检测器（FLD）电化学检测器（ECD）示差折光检测器（RID）蒸发光散射检测器（ELSD）（10-9g/ml）（10-12g/ml,用途窄）（10-9g/ml,用途窄）（10-

6、8g/ml，流动相需挥发性，且不可含盐，有样品损失）（低，？g/ml）利用样品池和参比池之间折光指数的差别来对组分进行检测。折光指数的差别与组分的浓度成正比离子、氧化还原物质可被激发产荧光的物质固定波长（254nm）任意可调波长（但只能同时用一种波长检测）光电二极管阵列型（PDAD）可对每一个峰同时连续波长扫描，得到时间、吸光度、波长的三维光谱－色谱加和图（对溶剂本身有响应，噪音大，基线漂移厉害，不适合梯度洗脱）HPLC用途指纹图谱分析（成份展示、比较与定性）定性与定量分析（如比较鉴别、含量测定）色谱条件选择制备分离纯度分析传代菌株次生代谢产物稳定性的指纹图谱分析菌株比较、发酵条

7、件比较等等分析型、半制备型、制备型HPLC分析型半制备型制备型载样量ug---<5mg5mg－100mg5mg－1g填料粒度3-5um10um5-30um柱尺寸直径4.6、5、2mm,长250-300mm左右直径8～10mm，,长250-300mm左右直径20-40,长100-300mm最大压力400bar200bar100bar流速0.01~10ml/min0.01～80ml/min30-100ml/min分辨率高较高相对低检测器流量池体积、池压＜10ul，＜70bar＜10u