微生物次生代谢产物研究方法-2

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1、色谱学基本原理与分类薄层色谱分析型、制备型各种常用(常压)液相柱色谱正相柱、反相柱、凝胶柱、大孔吸附树脂柱、活性炭柱、聚酰胺柱、离子交换柱、干柱色谱第二讲色谱学原理与实际应用（1）一、色谱原理与分类色谱法(chromatography)早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二

2、字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。起源：原理：当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。概念：在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相；运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱或层析柱。固定相流动相其他概念：分配系数(K)分配比/容量因子(k

3、)滞留因子(Rs)跟物质、两相、温度有关，表征了组分在特定条件下在固定相上的“吸附牢固程度‘还跟两相体积比有关K与k值越大（RS越小），保留时间越长一般小于1，不同组分间RS差别越大，分离效果越好保留值样品从进入到流出色谱柱的时间空白溶剂流过色谱柱的时间，跟柱床体积、流速有关tR－t0，样品本身流过柱子真正需要的时间死时间(t0)保留时间(tR)调整保留时间(t’R)保留体积(VR)死体积(V0)调整保留体积(V’R)理论塔板数(n)影响色谱分离效果的因素：组分容量因子(k)的差别(分离系数a：两组分k值之

4、比)粒度与均匀度（涡流扩散）温度（纵向扩散）流动相粘度与分子量（纵向扩散）流速等分类：按流动相分：按分离机制分：吸附色谱（固定相为固体）分配色谱（固定相为涂渍或键合在支持物上的液体）离子交换色谱（离子交换树脂、离子交换纤维素）空间排阻色谱（分子筛机制）复合机制色谱毛细管电泳法毛细管电色谱法面正相色谱（固>流）反相色谱（固<流）极性二、天然产物化学研究中常用色谱手段薄层色谱分析型、制备型柱色谱正相柱、反相柱、凝胶柱、大孔吸附树脂柱、活性炭柱、聚酰胺柱、离子交换柱、干柱色谱；减压柱色谱、中低压柱色谱、高压液相色

5、谱、气相色谱1薄层色谱（TLC,thinlayerchromatography）分类：吸附薄层色谱法分配薄层色谱法（分子排阻薄层色谱法）原理：固定相（吸附剂或载体）在玻璃板、铝板等基质上涂布成一均匀薄层，点样，在密闭的容器中展开，展开剂/流动相借助毛细管作用流经固定相，使组分分离并保留在固定相上。机制固定相正相板反相板硅胶板氧化铝板载样量分析型制备型基本概念比移值(Rf值)溶质移动距离与流动相移动距离之比。（速度之比）Rf=L/L0（定时展开）L为原点（origin）至斑点中心的距离，L0为原点至溶剂前沿（

6、solventfront）的距离与组分及色谱条件有关（有系统误差，有时很大）相对比移值(relativeRf；Rr)Rr=Rf(i)/Rf(s)=L(i)/L(s)与组分、色谱条件、参考物质有关。Rr值可以大于1，也可以小于1。重现性和可比性均比Rf值好，能消除系统误差（参考物质与组分在完全相同的条件下展开，共点样）1.1分析型薄层层析正相板常用吸附剂（固定相）：硅胶GF254或（酸性/中性/碱性）氧化铝（含黏合剂、荧光剂）流动相：有机溶剂层析装置：层析缸上样：毛细点样管或微量注射器（定量）上样量：几微克～

7、几十微克用途：1.定性分析（Rf，Rr）（如柱层析过程中的点板检测合并、化合物纯度检验、提取物的指纹图谱）2.定量分析（结合薄层扫描等方法）3.为柱层析选择合适的色谱条件吸附薄层层析原理（当正相板吸附水分较少时）：吸附过程是样品中组分分子与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，组分在薄层板上吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，……，利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离。一般极性强的组分K大，Rf值小；极性弱的组分K小，Rf值大。极性强的溶剂洗脱力争夺吸附剂活性中心能力强，洗脱力度大，反之极性小的溶剂洗脱力度

8、也小。一般用强极性与弱极性溶剂配成一定比例的混合溶剂可以达到较好的分离效果。分配薄层层析原理（当正相板吸附水分较多时）极性溶剂如水吸附在硅胶等基质表面成为固定相，多次分配的过程，分配系数（溶解度）不等实现分离。迁移规律同上两类机理TLC常用正相吸附剂氧化铝（Al2O3）活性基团铝醇基，氧化铝具有分离能力强、活性可以控制等优点。碱性氧化铝pH9～10适于分析碱性、中性物质（尤其是生物碱类）中性氧化铝pH7.5适于分