微生物次生代谢产物研究方法

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1、微生物次生代谢产物的下游研究方法张翼基本流程菌种发酵培养菌体发酵液前处理、富集提取粗提物分离纯化传统方法色谱方法单体化合物结构鉴定波谱学手段单晶衍射化学反应活性评价、构效关系活性引导分离或系统分离课程安排第一讲：发酵、前处理与传统分离方法第二讲：色谱学原理与实际应用（1）第三讲：色谱学原理与实际应用（2）第四讲：波谱分析概论及紫外、红外、质谱第五讲：一维与二维核磁共振谱第六讲：核磁共振谱解析实例第七讲：其他结构鉴定常用（波谱）方法第八讲：化合物波谱综合解析实例一、发酵培养与提取1.1微生物大规模

2、发酵培养的方式(1)液体静置培养（实验室规模）适用：丝状真菌（三角烧瓶，好氧）厌氧细菌（密封瓶）优点：经济，无需专门设备缺点：生长相对缓慢第一讲发酵、前处理与传统分离方法培养基：碳源/能源、氮源、生长因子、无机盐、水生长曲线及其与次生代谢关系迟滞期、指数期、稳定期、衰亡期种子对发酵的影响(2)摇瓶培养（实验室规模）适用：细菌、放线菌、真菌（厌氧菌不太适宜摇瓶培养，密封瓶一般体积、重量过大）优点：传质好、溶氧充分，从而生长迅速、周期短缺点：要进行大规模发酵需要大量摇床，占用空间大。(3)发酵罐培养通

3、气发酵罐（好氧细菌、放线菌、真菌）厌氧发酵罐（如啤酒、有机酸、酒精的发酵生产，次生代谢研究？）光生物反应器（光合细菌、微藻）优点：传质效率高、溶氧充分（好氧菌）、温度、pH等参数可控，生长迅速，培养量大缺点：昂贵(4)固态发酵适用：丝状真菌与酵母（如醋、酒酿造，豆豉生产等，酶制剂、维生素、生物毒素、抗生素），现在细菌上也有应用优点：供氧充分，散热及时，条件粗放、成本低，下游处理方便缺点：过程控制、大型化等方面有待改进1.2发酵液的前处理含水多，产物含量低；含菌体及水溶性蛋白；溶有原来培养基成分；相

4、当多的副产物和色素；易被杂菌污染或产物可能会分解；易起泡，悬浊物及粘性物质（多糖）多。目标产物胞内产物（菌体）胞外产物（发酵液/水相）1.2.1发酵液的复杂组成/特点1.2.2前处理目的、原则与流程时间短；温度低；pH适中（比较稳妥）；生物安全（不可忽视）固液分离浓缩富集目的原则固相（滤渣）：菌体及悬浊物等水相：胞外次生代谢产物（与部分水溶性大分子）前处理的一般流程也可索氏提取二、分离与纯化活性引导的分离对于显示有特定生物活性的粗提物，在分离纯化过程中每一步都用该筛选模型跟踪分离有活性的组分，直至

5、分离得到具有活性的纯化合物。特别适用于主要对活性成分感兴趣的研究。优点：是天然产物化学研究的一个重要的新趋势；能集中精力，有目的性的分离想要得到的活性物质；分离和结构解析的工作量相对都较小；有清晰的研究思路，对于文章写作有一定好处。弊端：不能保证有活性的化合物一定为新化合物，有一定风险；有可能会漏掉在该筛选模型中无活性，但有可能具有其他潜在生物活性的新化合物；活性跟踪有时受限于“协同效应”；不方便同时跟踪多种活性两种分离纯化策略活性引导的分离系统分离系统分离对于经过或未经过生物活性筛选的提取物，在

6、分离纯化过程中不经筛选模型的跟踪指导，分离纯化所有能够得到的纯化合物，并解析结构。最后再根据是否为新化合物及化合物的结构特点，参考相关文献报道或活性预测软件等来进行广泛的生物活性筛选。偏重于传统的天然产物化学研究方法，比较适合冷僻的生物材料和不注重生物活性的研究。优点：不容易漏掉提取物中含有的、能分离到的新化合物，有利于专利申请、文章撰写，也能兼顾各种生物活性。弊端：目的性不明确/有一定盲目性；分离纯化与结构解析的工作量巨大；波谱测试费用比较大两种方法相结合，以活性引导为主线，兼顾系统分离基本原则

7、尽量快速低温旋转蒸发（一般低于50摄氏度）；冷冻干燥；样品低温保存避光防氧化旋转蒸发；有些样品需氮气保护溶剂尽量不破坏天然成分丙酮（与二醇反应成缩酮）；乙酸乙酯（成酯）；氯仿（酸性）2.1传统的分离方法(1)萃取/溶剂分配法相似相溶原理极性化合物易溶于极性溶剂，非极性化合物易溶于非极性溶剂，同类分子或官能团相似的彼此互溶。（一条基本原则）如单糖、寡糖、糖苷易溶于水或醇，酚类化合物易溶于甲醇，长链脂类化合物易溶于石油醚、氯仿常用溶剂极性(介电常数)甲酰胺(109)＞水(80)＞甲酸(58)＞乙腈(3

8、6.3)＞甲醇(33)＞乙醇(24.3)＞丙酮(20.7)＞正丁醇(17.8)＞乙酸乙酯(6.02)＞乙醚()＞氯仿(5.2)＞二氯甲烷()＞甲苯＞苯(2.3)＞二氯乙烷()＞四氯化碳(2.24)＞二硫化碳()＞环己烷()＞正己烷(2.0)≈石油醚()。影响化合物极性的因素：(1)化合物分子母核大小（碳数多少）：分子大、碳数多，极性小；分子小、碳数少，极性大。(2)取代基极性大小：在化合物母核相同或相近情况下，化合物极性大小主要取决于取代基极性大小。常见基团极性大小顺序如下；酸＞酚