实验一 蛋白质的等电点测定和沉淀反应1

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1、实验一、蛋白质的等电点测定和沉淀反应一、目的1.蛋白质的两性解离性质和等电点2.学习测定蛋白质等电点的一种方法3.加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识4.了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义二、实验原理(一)蛋白质的两性性质和等电点Pr为两性电解质，除了含有自由羧基、氨基外，还有酚基(Tyr)、巯基(Cys)、胍基(Arg)、咪唑基(His)等可解离基团-------酸性和碱性基团pHpIpH=pIpHpI等电点:当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动

2、，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同的蛋白质有不同的pI蛋白质等电点蛋白质等电点胃蛋白酶1.0-糜蛋白酶8.3卵清蛋白4.6-糜蛋白酶原9.1血清蛋白4.7核糖核酸酶9.5-乳球蛋白5.2细胞色素C10.7胰岛素5.3溶菌酶11.0血红蛋白6.7鱼精蛋白12.0等电点沉淀法静电状态时蛋白颗粒之间的静电斥力最小，溶解度最小，易沉淀;猪胰腺提取胰岛素（pI=5.30--5.35），可以先调节组织匀浆pH呈碱性，使碱性蛋白沉淀析出，再调节组织匀浆pH呈酸性，使酸性蛋白沉淀析出，然后调上清液pH至5.3，得到胰岛

3、素粗品。电泳：溶液pH值

4、纯化的蛋白质脱氯化铯、蔗糖等小分子物质蛋白质是一种稳定的亲水胶体水膜（水化层）：蛋白质分子表面有亲水基团，对水有较大吸引力，分子表面会吸附水（0.4克水/克蛋白质）。水膜使蛋白质颗粒彼此分开，不易聚集而沉淀。带同种电荷：同性相斥，使蛋白质分子彼此保持一定距离，不易聚集而沉淀。(二)、蛋白质的沉淀precipitation实质：破坏水膜或带同种电荷这种状况与变性后蛋白质沉淀有区别变性-----构象变化---分子形状改变------分子表面亲水基团减少------疏水基团增加----蛋白质的水溶性下降-----沉淀但也有例外

5、：在偏酸或偏碱时有时表现为溶解状态沉淀-----可能变性，也可能不变性，取决于沉淀的方法和条件是否破坏了空间构象。沉淀蛋白质的方法：盐析法有机溶剂沉淀法生物碱沉淀法重金属沉淀法1.盐析法salting--out定义：在蛋白质水溶液中，加入一定量中性盐（NH4）2SO4，NaCl，Na2SO4等使蛋白质沉淀的作用称为盐析salting-out。盐析原因：破坏了水膜；大量中和蛋白质颗粒上的电荷，使蛋白质成为不带电荷的颗粒。盐析法优点：应用广泛，设备简单，操作方便，蛋白质并不失活，在一定条件下可以重新溶解。--------用于

6、制备活性蛋白质。盐析法缺点：混入大量中性盐，脱盐--------透析法分段盐析法：不同蛋白质分子量不同，带电状况不一，盐析时所需的盐溶度不同，可以通过控制混合蛋白质中的盐溶度，使各种蛋白质先后分别沉淀，从而达到分离目的。2.有机溶剂沉淀法能与水互溶的有机溶剂：乙醇，丙酮等原因：1）有机溶剂的介电常数小于水丙酮21，乙醇26，水76蛋白质溶液中加入有机溶剂后，降低了溶剂的极性，削弱了蛋白质与溶剂之间的相互作用，相应的增加了蛋白质颗粒之间的相互作用。2）破坏水膜，起脱水作用。有机溶剂与水的亲和力大。同样可以通过控制混合蛋白质

7、中的有机溶剂浓度，使各种蛋白质先后分别沉淀，从而达到分离目的。注意点：1.浓度不能太高，加入时要不断轻轻搅拌，以防局部浓度太高；2.低温操作：与水混合时会产生大量热量，引起蛋白质热变性；3.短时间。沉淀后，要迅速将蛋白质和有机溶剂分开。优点：有机溶剂易蒸发除去。3.生物碱试剂沉淀法生物碱：单宁酸（鞣酸）、苦味酸、磷钼酸、三氯醋酸等用于去杂蛋白临床用于测定尿液蛋白质含量原因：4.重金属盐沉淀法：Pb2+，Ag+，Hg2+，Cu2+可以解除重金属中毒或去杂蛋白三、主要器材四、操作步骤（一）酪蛋白等电点的测定1）取

8、同样规格的试管4支，加入各试剂，然后混匀。此时4个管的pH依次为5.9、5.3、4.7、3.5。2）各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。HAc（二）蛋白质的沉淀及变性1、蛋白质的盐析5ml卵清蛋白+5ml饱和(NH4)2SO