血友病B基因治疗

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1、作用结果表现在诱导相关细胞因子产生、或改善T淋巴细胞的功能。TPO联合FLT-3配体可以促进造血祖细胞中的类浆细胞样树突细胞的增殖叫联合IL・16可以产生免疫耐受的树突细胞，从而诱导产生无免疫应答的T细胞，为治疗自身免疫性疾病提供了新的方法叫在体外，TPO通过剌激IFN■诱导基因家族的表达，增加IFN-a的产生。Adams沟等报导，TPO基因转导使辐射去T淋巴细胞小鼠胸腺内T淋巴细胞重建速度明显加快。TPO的表达可诱导小鼠血液中IFN・y、TNF-a及IL・2的水平升高。TPO基因转导还可促使小鼠体内淋巴细胞的增殖、分化加快，特别是CD4+亚群出现明显的增多。值得一提的是,TPO在抗辐射过程

2、中也具有一定的保护作用。NeeUs^等实验表明，接受亚致死剂量的放射线照射后(M小时，给予TPO可以明显缓解实验鼠外周血中的血小扳减少，同时还可加速红细胞和粒细胞恢复。进一步的实验表明多潜能干细胞对TPO是敏感的，TPO可能阻止这些在全身照射(Totalbodyirradiation,TBI)作用下多潜能干细胞的凋亡。这种保护作用具有时间效应，TBI后2小时内使用TPO,干细胞对TPO产生的保护效应更敏感，相同的结果也在致死量的TBI动物实验中得到验证。另外，近来的研究认为,TPO可能参与机体损伤的保护和修复。TPO水平在急性创伤病人的血浆中显著升高，且升高与血小板数目没有明显的相关，提示创

3、伤后的TPO水平改变可能是机体应激反应性升高，以激活自身的保护机制使组织得以保护'TPO还有促进成纤维细胞生长作用，可能参与创伤的修复与愈合。创伤致使大量出血会导致不同程度的血小板减少从而通过正反馈而调节体内的血液TPO升高也可能是TPO升高的原因之一㈣。血友病B基因治疗中南大学湘雅医院陈方平、周淑娟、彭捷.王华血友病B是一种遗传性出血性疾病，患者因血液中缺乏擬血因子IX(FIX)而导致严重的凝血功能障碍,1952年由Aggeler和Biggs首先明确病因，目前已发现hFIX基因突变已达2100多种。编码hFIX蛋白的基因于1982年被克隆，定位于Xq27.1区带，全长33.5kb。该病为X

4、染色体连锁隐性遗传，在男性中发病率约三万分之一，女性携带者一般没有出血症状。该病的主要症状是自发性或轻微外伤后出血不止，严重者可因关节出血而导致关节畸形或残废，甚至内脏或颅内出血而死亡。目前主要的治疗方法为替代治疗，在出血发生时输血，补充血液制剂(毅血酶原复合物、浓缩人F氏等)。基因治疗是二十世纪八十年代以后发展起来的一种全新的疾病治疗模式，其定义是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导人人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。血友病B是目前最适合基因治疗的病种之一。这是因为，第一，它对基因表达的要求不严格，IX因子表达水平的范围可以很宽；

5、第二，对靶细胞的要求不严格；第三，目前已有较多成功的动物模型便于临床前试验的开展。国际上从八十年代中期就开始了血友病B的基因治疗研究工作。基因治疗的关键在于载体和靶细胞。血友病B的基因治疗需要一个高效安全的、免疫原性弱的并且能够介导基因长期稳定表达的基因转移系统。属于微小病毒科的2型腺相关病毒(AAV2)的天然特性更接近于基因治疗对载体的基本要求。已有许多学者证实了AAV介导的hFIX可在正常鼠、血友病鼠、血友病犬中得到长期有效的表达。靶细胞的选择对hFIX的表达极其重要，它关系到给药方式。体外FIX表达已经在几种细胞系及原始细胞中获得成功，如成纤维细胞、肌细胞、肝细胞、内皮细胞等。但其给药

6、途径均有创。其结果导致患者在基因治疗过程中增加了出血的风险性，并且需要大剂量输注嚴血因子IX(FK)的浓缩制品，增加了患者的经济负担,而且对于一些患儿存在着依从性差的问题。基于以上目前基因治疗存在的问题，我们需要一种方便、无创的基因治疗给药途径，来达到在最低风险的情况下治愈血友病B的目的。我们设想如果以肠上皮细胞作为FIX的靶细胞，则可能实现无创给药的目的；且肠上皮细胞具有数最众多，分裂增殖旺盛,肠粘膜下有丰富的毛细血管网可供基因表达产物入血，受消化酶影响小等特点。因此我们实验室的杜建伟等用肠上皮sw480细胞株转导人擬血因子IX核糖体靶向载体后，可检测到有凝血活性的hFIX,马泳泳等体外试

7、验也证实rAAV2AiFIX可体外转染肠上皮细胞并能够表达hFIXe这些实验已经证实，不同载体进行体外转染肠上皮细胞均能够表达具有生理活性的hFIX,说明以结肠上皮细胞做基因治疗靶细胞的可行性。在以上实验的基础上，我们实验室的王华、彭捷等设计动物实验来进一步研究rAAV2/hFIX通过灌肠给药后hFIX基因在血友病B鼠体内的表达以及安全性。将rAAV24iFIX按1x10%.g/kg的剂量结肠灌注给实验组小鼠