血友病b的基因治疗

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1、血友病B的基因治疗中华血液学杂志 2013-10-15 分享血友病B是一种X染色体连锁隐性遗传病，因编码基因的改变而导致凝血因子Ⅸ（FⅨ）的缺乏。在男性中发病率约为1/25000，依据血浆FⅨ活性（FⅨ∶C）分为重型（FⅨ∶C<1%）、中间型（FⅨ∶C1%~5%）和轻型（FⅨ∶C>5%，≤40%）。目前该病主要治疗手段为替代治疗（输注血浆提取物或重组FⅨ制剂），但反复输注外源性FⅨ可引起FⅨ抑制物形成、血制品输注相关疾病且医疗费用昂贵。基因治疗则为血友病的长期缓解乃至治愈带来了希望。靶组织或细胞选择范围广泛、FⅨ基

2、因片段小、低水平表达即可明显改善出血、具有良好的动物模型等优势，使得血友病B成为基因治疗领域进展最为迅速的疾病之一。一.载体系统1.腺相关病毒载体：腺相关病毒载体（AAV）是目前血友病B基因治疗最有前景的载体。AAV是一种可感染人细胞、具有天然复制缺陷的单链DNA病毒，与已知人类疾病无关。AAV较之其他病毒载体具有免疫原性弱、转染效率高、可转染非分裂细胞、表达稳定且持续时间长等优点，缺点为容量小、基因表达滞后。AAV包括AAV1、2、5、6、7、8、9等多种血清型。AAV2是应用最早、最广泛的血清型，可有效转染多种

3、细胞，但人类是AAV2的天然宿主，人群中AAV2血清抗体阳性者较为常见。其他几种血清型则有不同的转染趋向性：AAV1具有明显的骨骼肌趋向性，AAV6具有心肌趋向性，AAV8具有明显的肝趋向性。针对不同的靶组织可以考虑选择趋向性不同的AAV。总体而言，AAV7、8、9产生的免疫反应较AAV1、2、5轻。Wang等分别应用AAV1、2、5、7、8、9对FⅨ基因敲除小鼠和患血友病B犬进行基因治疗，然后对血浆中FⅨ∶C、抗FⅨ特异性IgG1和IFN-γ进行检测，以比较其转染效率和免疫反应。结果显示以肌肉组织作为靶组织时，A

4、AV7、8、9转染效率高于AAV1、2、5，未发现针对导入的FⅨ基因的B细胞反应，针对病毒衣壳蛋白的T细胞反应程度亦较弱。自身互补AAV载体（self-complementaryAAV,scAAV）的发明则弥补了传统单链AAV载体（singlestrandedAAV,ssAAV）表达滞后的缺点。ssAAV表达滞后的原因在于其进入靶细胞并脱壳后，首先要合成互补DNA链才能进一步表达。scAAV则是将载体基因设计成1个单链反向重复序列，当载体进入靶细胞后即可折叠形成1条互补双链，从而绕开影响基因表达速度的步骤。Nath

5、wani等采用scAAV5和scAAV8作为携带FⅨ编码基因的载体对患血友病B猕猴进行基因治疗并研究其安全性。研究者将猕猴分为5组，分别从外周静脉注射2×109~2×1012载体基因组（vg）/kg共5个剂量级的载体，然后对基因表达效率和安全性进行了长达5年的观察。研究发现，当载体剂量达到6×1010vg/kg时，猕猴血浆FⅨ∶C维持在1%以上；所有的猕猴均产生了血清型特异性抗体，未发现衣壳蛋白特异性T细胞反应和免疫介导的肝损伤，同时没有观察到AAV基因整合到靶细胞基因序列中和肝脏肿瘤的发生。该研究及大量制备scA

6、AV的方法为临床试验打下了基础。AAV的缺点为包装容量较小，影响了在血友病A等其他基因缺陷性疾病的应用。2.逆转录病毒载体：逆转录病毒载体（RV）是最早应用于基因治疗的病毒载体，但仅对分裂细胞有效，对非分裂细胞则无效。Zhang等以RV作为载体、以肝脏作为靶组织对新生血友病B犬和新生基因敲除血友病B小鼠进行基因治疗，结果显示所有动物中FⅨ∶C>10%，无FⅨ抑制物形成。但成年动物的肝脏中分裂细胞不足，有报道以手术切除部分肝脏的方法诱导肝细胞增殖，再应用RV进行基因治疗，但该治疗方法创伤较大，与其他载体相比劣势较为明

7、显。3.腺病毒载体：腺病毒载体（AV）可转染分裂细胞和非分裂细胞。腺病毒基因不与宿主基因整合，不会因为基因整合而导致抑癌基因失活。人群可天然感染腺病毒而易预存免疫反应。第二代AV（高容量AV）腺病毒本身的编码基因被去除，可以降低宿主免疫反应，延长导入基因表达持续的时间。4.慢病毒载体：慢病毒载体（LV）是以HIV-1为基础发展起来的基因治疗载体，可转基因至分裂细胞和非分裂细胞，对包括肝在内的各种组织都可转染，也可将载体基因整合至宿主基因中。因为LV来源于HIV，在普通人群中少有感染，很少有预存免疫反应，在基因治疗上

8、具有一定的优势。但是应用LV作为载体进行基因治疗时，FⅨ∶C仅接近1%，且有一过性急性促炎性免疫反应发生。Brown等应用携带肝细胞特异性启动子的LV载体对基因敲除血友病B小鼠进行治疗，FⅨ∶C因抗FⅨ的T细胞反应而未达治疗水平（<1%），当他们在载体中再包进一段造血特异性miRNA后进行基因治疗，小鼠体内FⅨ∶C持续高于15%且未发生明显的免疫反应，分析认