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1、《发酵工程综合实验》实验指导书生物工程系实验一乳酸分批发酵实验一、实验目的1.了解乳酸发酵常用的发酵菌种。2.掌握乳酸发酵的工艺控制过程和方法。3.能熟练运用发酵过程的基本原理，根据实验的不同要求，正确地设计实验方案，并按照实验方案进行实验研究。二、实验原理分批操作又称间歇操作，指培养基灭菌、冷却后，接入微生物菌种，维持一定的反应条件进行反应。反应过程中不再加入反应基质，也不输出产物，只有等待反应进行到规定的程度后，才将全部发酵液放出的操作过程。按发酵过程中生成产物的不同，可以将乳酸发酵分为同型和异型发酵，若产物仅为乳酸,则为同型
2、发酵，若产物为乳酸、酒精、乙酸等，则为异型发酵。多数乳酸产生菌不耐酸，发酵时中和剂可采用碳酸钙、红氧化钙、氨水、红氧化钠等。工业匕，乳酸生产菌冇徳氏乳杆菌（Lactobacillusdelbrueckii）、赖氏乳杆菌（Lcictobacillusleichmannii）＞植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）米根霉｛Rhizopusoryzae）等。三、材料与分析方法1.菌种：米根霉（Rhizopusoryzae）As3.819。2.培养基（1）斜面培养基：PDA培养基。⑵种子培养基（g/dL）：葡萄糖8,（
3、NH4）2SO20.4,W薯淀粉2,MgSO4-7HO20.025,ZnSO4-7HO20.044,KH2P040.02,FeSO40.001,CaCO30.2,装液最：lOml/lOOml三和瓶。（3）发酵培养基（g/dL）：廿薯淀粉15,（NH4）2SO2O.4,MgS047H02.025,ZnSO4-7HO20.044,KH2PO40.03,100ml/500ml三如瓶，CaCO37（分开火菌）。3.分析方法（1）pH：采用酸度计或pH试纸测定。（2）乳酸定性测定：纸层析法。展开剂为水：苯卬醇：正丁醇=1：5：5；显色剂为0
4、.04%的漠酚蓝洒梢溶液，用0.1M的氢氧化钠调节pH到6.70（3）乳酸定量测定：EDTA定钙法。（4）生物最的测定:干重法。将菌丝体过滤，用稀盐酸或去离子水洗2〜3次后，置60-80°C干燥箱至恒重。（5）还原糖的测定：斐林试剂法。（6）氨基氮的测定：参考《工业发酵分析》中的相关测定方法。（7）乳酸的提取：50%硫酸酸解法。収预处理后发酵液，根据发酵液中钙离子的含量，按照鈣离了与硫酸根1：1（摩尔比）的量加入50%硫酸直接酸解。四、实验方法与步骤1•固体种了培养/斜面培养：32°C培养3天。2.液体种了培养：种了培养基经115
5、°C灭菌20分钟后，接入抱了使得种了液的抱了浓度达到10,6个/ml,温度为32±TC,以200rpm的转速于摇床培养18-24h03.发酵培养：发酵培养基115°C灭菌20分钟后，按10%接种，以32°C、200rpm的转速置于摇床发酵60-72hoCaCO.3在第20h单独加入。4.米根霉发酵牛产乳酸最佳条件：改变发酵的某一条件如碳源、碳源浓度、氮源、氮源浓度、种龄、温度、转速、装液量等，测定发酵周期，乳酸产量、产率，碳源利用率等，以确定该菌株的最佳发酵条件。五、结果与分析1.该发酵菌种的生长特性，绘制菌种生长及代谢产物形成与
6、培养时间的关系曲线。2.构建该菌株在最佳发酵条件卜-的细胞生长、底物利用和产物形成动力学模型。3.找出该菌株发酵生产乳酸的主要影响因素，确定其最佳发酵条件。附录（一）还原糖的测定1、试剂配制（1）斐林氏甲乙液甲液：称取分析纯硫酸铜35®次甲基蓝0.05g,用蒸镭水溶解后稀释至lOOOmLo乙液：称取分析纯酒石酸钾钠H7g,分析纯氢氧化钠126.4g,分析纯亚铁氮化钾（黄血盐）9.4g,用蒸馅水溶解后稀释至lOOOmLo（2）0.1%标准匍萄糖溶液准确称取已烘干的无水葡萄糖lg（无水葡萄糖预先在烘箱内以110C烘干至恒重，时间约2h
7、）,用少量蒸饰水溶解，加入5mL盐酸防腐，并用蒸饰水定容至1000mLo2、测定步骤①斐林氏液的标定（即空口滴定）吸取斐林氏甲、乙两液各5mL于250mL三角瓶屮，预加0.1%的标准葡萄糖液适量，加蒸馆水10mL,（以点沸时斐林氏液仍呈现蓝色者为宜。如斐林氏液变为无色，说明加糖量已过量，应重做）。煮沸2min后，继续滴加0.1%葡萄糖液至蓝色刚变成无色为终点。继续滴加的操作，应在lmin内完成。记录所耗标准葡萄糖的总毫升数A。②定糖I、准确吸収斐林氏甲、乙液各5mL放入250mL三角瓶中。II、用吸管吸取ImL检液加入三角瓶中，从
8、滴定管加入0.1%标准葡•萄糖液约10mL。III、置电炉上加热煮沸2min（如发现蓝色消失，则表示检液过浓或标准葡萄糖液过量,应予适当的稀释或取鮫少的检液重做）oIV、在沸腾下继续滴加0.1%标准葡萄糖液至蓝色刚消失为终点。此操作必须在lmin内
