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1、食品中大肠菌群检测作业指导书1.1=1的：规定了木屮心大肠菌群(Coliforms)的计数方法.2•适用范帀：适用于食品中大肠菌群的计数。3.编写依据：GB4789.3-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验人肠菌群计数》.4.术语和定义：4.1大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰阴性无芽胞杆菌。4.2最可能数mostprobablenumber,MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。5.设备和材料：除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1恒温培养箱：36°c±rc5.2冰箱：2°C〜5°C5.3
2、恒温水浴箱:46°C±rC5.4天平：感量0.lg5.5均质器5.6振荡器5.7无菌吸管:ImL(具O.OlmL刻度)、lOmL(具O.lmL刻度)或微量移液器及吸头5.8无菌锥形瓶：容量500mL5.9无菌培养皿：直径90mm5.10pH计或pH比色管或精密pH试纸5.11菌落计数器6.培养基和试剂：6.1月桂基硫酸盐胰蛋白月东(LaurylSulfateTryptose,LST)肉汤：见附录A中A.16.2煌绿乳糖胆盐(BrilliantGreenLactoseBi1e,BGLB)肉汤：见附录A中A.26.3结晶紫中性红胆盐琼脂(VioletRedBileAgar
3、,VRBA)：见附录A中A.36.4磷酸盐缓冲液：见附录A中A.46.5无菌生理盐水：见附录A屮A.54.6无菌1mol/LNaOH：见附录A中A.66.7无菌1mol/LHC1：见附录A中A.7第一法大肠菌群MPN计数法4.检验程序：大肠菌群MPN计数的检验程序见图lo图1大肠菌群MPN计数法检验程序4.操作步骤：8.1样品的稀释8.1.1固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225汕磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min〜10000r/min均质lmin〜2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打l
4、min〜2min,制成1:10的样品匀液。8.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225niL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。8.1.3样品匀液的pH值应在6.5〜7.5之间,必要时分别用Imol/LNaOH或lmol/LHCl调节。8.1.4用ImL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液ImL,沿管壁缓缓注入9mb磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支ImL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。8.1.5根据
5、对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递増稀释1次，换用1支51」无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15mino&2初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白陈（LST）肉汤，每管接种lniL（如接种量超过lmL,则用双料LST
6、«i）,36°C±1°C培养24h±2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h土2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。&3复发酵试验用接种环从产气的
7、LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36°C±1°C培养48h±2h,观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。&4大肠菌群最可能数（MPN）的报告按8.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B）,报告每g（mL）样品屮大肠菌群的MPN值。第二法大肠菌群平板计数法4.检验程序:大肠菌群平板计数法的检验程序见图2o图2大肠菌群平板计数法检验程序10.操作步骤：5.1样品的稀释按8.1进行。10.2平板计数10.2.1选取2个〜3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿ImL。同时取ImL生理盐水加入无菌平皿作
8、空口对照。10.2.2及时将15讥〜20mL冷至46°C的结品紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于侮个平1111中。小心旋转平111L,将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL〜dmLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36°C±1°C培养18h〜24h。10.3平板菌落数的选择选取菌落数在15CFU〜150CFUZ间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周圉有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0・5nmi或更大。10.4证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36
