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《一种具有双嗜性功能融合蛋白FNCDH的制备及其促粘附,成骨生物活性鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、一种具有双嗜性功能融合蛋白FN/CDH的制备及其促粘附、成骨生物活性鉴定向强I张崔翔，王加旭，刘明华
2、(400038重庆，笫三军医大学西南医院急救部400047重庆，第三军医大学新桥医院骨科3［摘要］目的构建一种具冇同嗜性利异嗜性细胞粘附功能的重纽融合蛋AFN/CDH,验证其对人骨懺间充质干细胞(humanmesenchymalstemcel1,hMSCs)的促粘附、成骨效能。方法以纤维连接蛋白(fibronectin,FN)和钙粘附蛋白ll(CDHll)作为前体分子，通过生物信息学分析了解其结构序列与功能基团。釆川“同源模建”作为分子模拟策略确定
3、1爪和CDH11功能片段的接合方式。常规PCR扩增FNIII7-10和CDII11EC1-2基因片段后应用重肴延仲PCR(splice-over-extensionPCR,S0E-PCR)进行基因拼接。将融合基因插入原核表达载体pET-22b构建璽组载体，重组载体转化表达菌株Rsoetta-gami(DE3),实现rFN/CDH的诱导表达，蛋白纯化。免疫印迹确定融合蛋白种屈，离心促粘附实验和成骨诱导验证rFN/CDH体外生物活性。结果成功构建了pET22b-FNlIl7-1O/CDH11EC1-2融合基因原核表达载体，获得了rFN/CDH的可溶性表达
4、，纯化后rFN/CDH的纯度达到96%。初步验证了各个融合蛋口农达属性的准确性，证实rFN/CDH具有良好的促进成骨细胞粘附的生物活性。将有成骨分化潜能的hMSCs在rEN/CDIl涂层的TCPS表而进行成骨诱导培养，以早期成骨标志物Alkalinephosphatase(ALP)和晚期标志物0steocalcin(0C)作为评价拆标，提示rFN/CDH具冇良好的促进细胞成骨分化的生物活性。结论成功进行了rFN/CDH融介蛋白的原核表达、纯化和鉴定，嵌合蛋白的粘附活性在一定程度上实现了对F7和CDH11功能的叠加，rFM/CDH具有“促粘”和“促成
5、骨”的欢重生物活性，可作为-种理想的仿生修饰分子进行生物界面的构建。［关键词］纤维连接蛋白；钙粘附蛋白；间充质干细胞；粘附；成骨分化［中图法分类号］［文献标志码］APreparationofFN/CDHamphotropicrecombinantproteinandastudyofitscapacityinpromotingosteoblasticadhesionandossificationXiangQiang1,CuiXiang,WangJiaXu,LiuMingHua1(DepartmentofEmergency,SouthwestHospit
6、al,ThirdMilitaryUniversity,Chongqing,400038/,DepartmentofOrthopaedics,XinqiaoHospital2,ThirdMilitaryUniversity,Chongqing,400()47,China)AbstractObjectiveTheaimofthisstudywastoinvestigatetheeffectofaamphotropicrecombinantproteinoffibronectinmoduleIII7-10/cadherin11EC1-2(rFN/CDH)o
7、ncelladhesionanddifferentiation.MethodsInthisstudy,FNandCDH11,astwoprc-molcculcsoftherecombinantprotein,wereanalysedbioinformaticallytoacquiredthestructuralsequencesandfunctionalgroups・ThefragmentsofFNandCDH11wereintegratedusingahomologymodelingstrategy.ThegenefragmentsofFNIII7
8、-10andCDH11EC1-2weresplicedbySOE-PCRandtheninsertedintotheexpressionplasmidofpE1^22bforareconstmctedvector.AftertransformingthevectorintoRsoetta-gami(DE3)strainandoptimizingtheexperimentalparameters,rFN/CDHwasinducedtoexpressusingIPTGandpurified・Furthei;immuno-blottingwasemploy
9、edtoverifytheidentityoftheprotein.Whilecentrifugalcell
