具有成骨诱导活性新型融合蛋白实验的研究

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1、第四军医大学博士学位论文缩略语表缩略语英文全称中文全称ALPAlkalinephosphatase碱性磷酸酶BMPBonemorphogeneticProtein骨形态发生蛋白bBMPbovineBMP牛骨形态发生蛋白DMEMDulbeco’smodifiedeaglemediumDulbeco改良MEM培养基EGFPEnhancedgreenfluorescenceprotein增强型绿色荧光蛋白IPTGIsopropy-β-D-thiogalactoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷FSFibrinsealant纤维蛋白胶LMP

2、LIMmineralizationproteinLIM矿化蛋白MSCMarrowstromalcell骨髓基质细胞PTDProteintransductiondomain蛋白转导功能域rhBMP-2recombinanthumanBMP-2重组人骨形态发生蛋白RT-PCRReversetranscriptionpolymerase反转录PCRchainreactionSmadSma-andMad-relatedproteinSma和Mad相关蛋白SmurfSmadubiquitinregulatoryfactorSmad泛素化调节因子

3、TGF-βTransforminggrowthfactor-β转化生长因子TATTrans-activatortranscription转录反式激活因子1第四军医大学博士学位论文独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有

4、不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：日期：保护知识产权声明本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容（含电子版，保密内容除外），可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。论文作者签名：导师签名：日期：1第四军医大学博士学位论文具有成骨诱导活性的新型融合蛋白的实验研究博士研究生：张

5、大伟导师：胡蕴玉教授辅导老师：李立文博士第四军医大学西京医院骨科，西安，710032中文摘要骨缺损的治疗是骨科基础研究与临床治疗的重要研究方向。骨组织工程学的发展，为骨缺损的治疗开辟了一个新的领域。骨组织工程学的研究内容主要包含种子细胞、支架材料和生物活性因子三个要素。生物活性因子在促使细胞增殖并诱导其分化方面具有重要作用。骨形态发生蛋白（BMP）是一类具有高效成骨诱导活性的蛋白质，在骨组织工程的实验研究和临床应用中都取得了很好的效果。目前常用的BMPs生产方法有真核表达和原核表达两种。真核表达产物活性高，然而生产成本甚高，使其产品无

6、法在临床推广应用。原核表达产物为无活性的包涵体，须经过复性成为正确折叠的二聚体才具有生物活性，但是复性工艺较为复杂，复性效率较低，活性不够稳定。采用特殊生产工艺后，原核表达BMPs生物活性有了较大提高，但在此过程中，生产成本迅速提高，而且在临床应用中，BMPs只有达到一定量后方能发挥成骨作用（毫克级），明显增加了病人的负担，不利于在临床大规模推广应用。因此寻找和研制具有稳定、高效成骨诱导活性，并且廉价的生物分子作为BMPs的替代物，成为矫形外科学领域的一个重要研究方向。LMPs是近年来研究发现的具有成骨诱导活性的细胞内蛋白，其成骨诱导

7、活性甚至优于BMPs。通过对LMPs三种差异剪接体一级结构分析发现，LMP1（1-133AA）是成骨诱导活性所必需的序列。本研究将蛋白转导作用域和LMP1（1-133AA）进行融合表达，利用蛋白转导作用域能将和其融合表达的蛋白分子转入细胞内的特点，2第四军医大学博士学位论文将LMP1（1-133AA）转入细胞内发挥生物学活性，以期获得一种新的、具有高效成骨诱导活性的新型融合蛋白。一、LMP1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达根据LMP1基因序列设计、合成引物。采用Trizol法提取MG63成骨肉瘤细胞总RNA，进行RT-

8、PCR，获得LMP1cDNA并克隆至真核表达载体pEGFP-N3，获得pEGFP-N3-LMP1真核表达载体。将该载体转染HEK293细胞，荧光显微镜下观察发现pEGFP-N3-LMP1质粒转染HEK293后产生荧光仅存