sahrantes融合蛋白的制备及其生物学功能鉴定

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1、温州医学院硕士学位论文SA/hRANTES融合蛋白的制备及其生物学功能鉴定姓名：董丽娜申请学位级别：硕士专业：免疫学指导教师：高基民2012-05-13温州医学院硕士学位论文SA／hRANTES融合蛋白的制备及其生物学功能鉴定中文摘要目的本文拟构建hRANTES．SA—pET21a和SA．hRANTES．pET24a重组表达质粒，通过转化入大肠杆菌诱导表达、Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析纯化、尿素梯度透析复性等方法，制备出链亲和素标记的hRANTES融合蛋白(hRANTES．SA和SA-bRANTES)，并研究其生物学功能，为进一步肿瘤细胞疫苗的研制及其临床

2、前研究奠定基础。方法1．构建SA／hRANTES重组质粒从人外周血淋巴细胞中提取总RNA，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因bRANTES，将目的基因和两种载体(IL．7．Linker-6His．SA．pET21a和6His—SA—Linker-IFN一0【．pET24a，均由本课题组保存)进行双酶切，然后连接并转化入DH5a感受态细胞，经菌落PCR鉴定和质粒酶切鉴定后送DNA测序。2．诱导表达SA／11RANTES融合蛋白将构建好的SA／hRANTES重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞，挑单克隆菌落初步诱导，筛选出高表达菌株。用SD

3、S．PAGE筛选最佳IPTG诱导浓度和诱导时问，优化诱导条件。收集工程菌，超声破碎或高压破碎菌体，用SDS．PAGE分析上清及包涵体表达产物，采用本室研制的包涵体洗涤方法洗涤包涵体。3．SA／hRANTES融合蛋白的纯化与复性洗涤后的包涵体用8M尿素溶解，进行Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析纯化，采用尿素梯度透析复性，并用SDS．PAGE和WesternBlot进行检测，通过BandScan软件分析SDS．PAGE电泳图中目的蛋白的纯度。利用Bradford法检测复性后的融合蛋白浓度。4．趋化试验和细胞锚定实验将复性的SA／hRANTES融合蛋白调整成不同浓度

4、，用PBS作阴性对照，利用趋化试验检测其是否对人外周血淋巴细胞有趋化活性；应用流式细胞仪检测SA／hRANTES融合蛋白对已生物素化的小鼠膀胱癌细胞MB49的锚定率，初步评价SA／hRANTES融合蛋白的体外生物学活性。结果1．构建SA／hRANTES重组质粒温州医学院硕士学位论文菌落PCR鉴定合格后，进行质粒酶切鉴定，hRANTES．SA-pET21a用NdeI和EcoRI酶切，SA．hRANTES．pET24a用EcoRI和HindIII酶切，均获得了与预期大小一致的两个片段。对两种重组质粒进行DNA测序，结果与GenBank收录的SA和人RANTES序列完

5、全一致，基因读码框正确。2．诱导表达SA／hRANTES融合蛋白将重组质粒转化大肠杆菌，经筛选后获得表达工程菌，SDS．PAGE显示，两种融合蛋白均出现在约29kDa大小位置，两种菌的最佳诱导条件均为IPTG终浓度0．2mmol／L，诱导时间4h。经BandScan软件分析，hRANTES．SA和SA．hRANTES融合蛋白分别约占总蛋白的30％、15％。大规模培养诱导工程菌，超声裂解后，SDS．PAGE检测，两种目的蛋白均以包涵体形式表达。3．SA／hRANTES融合蛋白的纯化与复性经Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析纯化后，SDS．PAGE和BandScan

6、软件分析，hRANTES．SA和SA．hRANTES融合蛋白的纯度分别为95％、80％。透析复性后，hRANTES．SA融合蛋白的非还原状态主要以多聚体形式存在，而SA．hRANTES融合蛋白并不主要以多聚体形式存在。WesternBlot显示，两种融合蛋白的单体和聚体形式均能与抗．His单克隆抗体结合，并发生DAB显色反应。4．趋化试验和细胞锚定实验体外趋化实验结果显示，hRANTES—SA融合蛋白有趋化人外周血淋巴细胞的活性，且最佳趋化浓度为100nmol／L，而SA．hRANTES融合蛋白基本无趋化活性。流式细胞仪检测hRANTES．SA和SA．hRANT

7、ES融合蛋白对生物素化的小鼠膀胱癌细胞MB49的锚定率分别为97．5％、84．2％。结论本文成功构建了hR．ANTES．SA．pET21a和SA．hRANTES．pET24a两种重组表达质粒，并转化大肠杆菌中诱导表达获得大量工程菌。通过Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析纯化、透析复性制备了hRANTES．SA和SA．hRANTES融合蛋白，并通过体外人淋巴细胞趋化试验和细胞锚定实验初步证实了hRANTES．SA融合蛋白在体外具有双重活性，但同法制备的SA．hRANTES融合蛋白复性后并不主要以多聚体形式存在，且基本无趋化活性，表明hRANTES在融合蛋白中的位置

8、与其复性及趋化活性有重要