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《关于一种具有双嗜性功能融合蛋白fncdh的制备及其促粘附,成骨生物活性鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、一种具有双嗜性功能融合蛋白FN/CDH的制备及其促粘附、成骨生物活性鉴定向强1，张瑗，崔翔，王加旭，刘明华1（400038重庆，第三军医大学西南医院急救部1；400047重庆，第三军医大学新桥医院骨科2）[摘要]目的构建一种具有同嗜性和异嗜性细胞粘附功能的重组融合蛋白FN/CDH，验证其对人骨髓间充质干细胞(humanmesenchymalstemcell,hMSCs)的促粘附、成骨效能。方法以纤维连接蛋白(fibronectin,FN)和钙粘附蛋白11(CDH11)作为前体分子，通过生物信息学
2、分析了解其结构序列与功能基团。采用“同源模建”作为分子模拟策略确定FN和CDH11功能片段的接合方式。常规PCR扩增FNⅢ7-10和CDH11EC1-2基因片段后应用重叠延伸PCR(splice-over-extensionPCR,SOE-PCR)进行基因拼接。将融合基因插入原核表达载体pET-22b构建重组载体,重组载体转化表达菌株Rsoetta-gami(DE3)，实现rFN/CDH的诱导表达，蛋白纯化。免疫印迹确定融合蛋白种属，离心促粘附实验和成骨诱导验证rFN/CDH体外生物活性。结果成
3、功构建了pET22b-FNⅢ7-10/CDH11EC1-2融合基因原核表达载体，获得了rFN/CDH的可溶性表达，纯化后rFN/CDH的纯度达到96%。初步验证了各个融合蛋白表达属性的准确性，证实rFN/CDH具有良好的促进成骨细胞粘附的生物活性。将有成骨分化潜能的hMSCs在rFN/CDH涂层的TCPS表面进行成骨诱导培养，以早期成骨标志物Alkalinephosphatase(ALP)和晚期标志物Osteocalcin(OCN)作为评价指标，提示rFN/CDH具有良好的促进细胞成骨分化的生物
4、活性。结论成功进行了rFN/CDH融合蛋白的原核表达、纯化和鉴定，嵌合蛋白的粘附活性在一定程度上实现了对FN和CDH11功能的叠加，rFN/CDH具有“促粘”和“促成骨”的双重生物活性，可作为一种理想的仿生修饰分子进行生物界面的构建。[关键词] 纤维连接蛋白；钙粘附蛋白；间充质干细胞；粘附；成骨分化[中图法分类号][文献标志码]APreparationofFN/CDHamphotropicrecombinantproteinandastudyofitscapacityinpromotingost
5、eoblasticadhesionandossificationXiangQiang1,CuiXiang,WangJiaXu,LiuMingHua1(DepartmentofEmergency,SouthwestHospital，ThirdMilitaryUniversity,Chongqing,400038,1,DepartmentofOrthopaedics,XinqiaoHospital2,ThirdMilitaryUniversity,Chongqing,400047,China)Abs
6、tractObjectiveTheaimofthisstudywastoinvestigatetheeffectofaamphotropicrecombinantproteinoffibronectinmoduleIII7-10/cadherin11EC1-2（rFN/CDH）oncelladhesionanddifferentiation.MethodsInthisstudy,FNandCDH11,astwopre-moleculesoftherecombinantprotein,werean
7、alysedbioinformaticallytoacquiredthestructuralsequencesandfunctionalgroups.ThefragmentsofFNandCDH11wereintegratedusingahomologymodelingstrategy.ThegenefragmentsofFNⅢ7-10andCDH11EC1-2weresplicedbySOE-PCRandtheninsertedintotheexpressionplasmidofpET-22b
8、forareconstructedvector.AftertransformingthevectorintoRsoetta-gami(DE3)strainandoptimizingtheexperimentalparameters,rFN/CDHwasinducedtoexpressusingIPTGandpurified.Further,immuno-blottingwasemployedtoverifytheidentityoftheprotein.Whilecentrifugalcella
